PENGECATAN SEDERHANA

A. Pembuatan preparat untuk pengecatan

Bahan berasal langsung dari penderita
Bahan dapat berupa: sputum, pus, discharge telinga, discharge hidung, urine (perlu
disentrifuge terlebih dahulu, endapannya dibuat preparat).
Cara:
 Bahan diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril digoreskan pada obyek gelas setipis
mungkin.
 Panaskan di atas nyala api spiritus sambil digoncangkan (jarak preparat sampai api spiritus
kira-kira 20 cm) sampai preparat tersebut kering.
 Setelah kering tetesi formalin 1% tunggu 5 menit dan keringkan sekali lagi dan preparat
siap dicat.

Preparat dibuat dari biakan cair

Cara:
 Ambil obyek gelas yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas
nyala api spiritus.
 Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya diaduk dulu secara steril) dengan
menggunakan ose steril, diratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-
kira 1-2 cm.
 Ose sesudah dipakai mengambil kuman harus disterilkan kembali dengan membakar di
atas nyala api spiritus dan sterilkan kembali sebelum dipakai lagi. Kemudian preparat ini
dikerjakan seperti di atas.
Perhatikan:
- Jangan memegang mata ose dengan menggunakan tangan.
- Jangan meletakkan ose di atas meja.
- Letakkan ose pada tempat yang telah disediakan dan sebelumnya ose disterilkan dahulu.
 Preparat dibuat dari pertumbuhan media padat
Cara:
 Teteskan satu ose kaldu pada gelas obyek yang bersih dan bebas lemak.
 Dengan ose steril ambil sedikit dari satu koloni kuman, campurlah dengan kaldu tersebut,
buatlah menjadi homogen dan tipiskan. Preparat kemudian dikeringkan di atas nyala api
spritus dan selanjutnya dikerjakan sebagai membuat preparat dengan bahan berasal dari
material langsung.

B. Pengecatan
Pada umumnya pengecatan dibagi atas 3 macam:
a. Pengecatan sederhana
Misalnya dengan menggunakan:
- Karbol fuchsin
- Gentian violet
- Methylen blue
b. Pengecatan differensial / Pengecatan majemuk
Misalnya:
- Pengecatan Gram
- Pengecatan Ziehl Neelsen
c. Pengecatan khusus:
Digunakan untuk melihat alat tambahan pada bakteri, misalnya kapsul, spora, granula,
flagella.

C. Pengecatan sederhana
Cara ini menggunakannya hanya satu macam cat saja. Biasanya baik bakteri maupun
sekitarnya akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Namun,
kadang-kadang bagian tertentu bakteri/alat tambahan, tidak mampu mengikat / menyerap zat
warna dari cat, sehingga terlihat sebagai daerah yang jernih.
Sebelum mengadakan pengecatan terlebih dahulu harus dibuat larutan cat induk yang
terdiri dari:
 Serbuk cat 5 gram
 Alkohol 96% 95 gram
 Dan dari larutan induk ini dibuat cat yang akan digunakan yang biasanya dalam kadar
10% dari larutan induk, diencerkan dengan menambah aquadest atau larutan phenol.
1. Larutan Methylen Biru
- 10 cc larutan induk methylen biru ditambah 90 cc aquadest
2. Larutan Fuchsin
- 10 cc larutan fuchsin induk ditambah 90 aquadest
3. Larutan Loeffler Methylen Biru
- Larutan induk: 1 gr Methylen Biru dilarutkan dalam 100 ml Ethanol 95%
- 30 cc larutan induk Methylen Biru ditambah hidras kalicus 1% sebanyak 1 cc dan
aquadest 99 cc.
4. Larutan Karbol Fuchsin
- Larutan induk: 10 gr Basic Fuchsin (Fuchsin basis) ditambah 100 ml Ethanol 95%.
- 10 cc larutan induk Fuchsin dengan 90 cc phenol 5%.
 JURNAL PRAKTIKUM

Judul : Pengecatan Sederhana

Metode : Sederhana
Tujuan : Untuk mengetahui bentuk kuman
Prinsip :

Kuman akan menyerap zat warna sesuai dengan zat warna yang diberikan.

Cara Kerja:

 Dibuat sediaan kuman dan difiksasi.

 Diwarnai dengan zat warna (pilih salah satu zat warna) selama ½ - 1
menit
 Sediaan dicuci dengan air.
 Dikeringkan dalam udara kamar.
 Diperiksa di bawah mikroskop.

Hasil Pengamatan:

Bentuk : ………………………………
Susunan : ………………………………
Warna : ………………………………
Cat : ………………………………
Perbesaran : …………………………..

Kesimpulan :
 PENGECATAN GRAM

Pewarnaan gram merupakan prosedur yang paling bermanfaat dalam Mikrobiologi

diagnostik. Ketika dicurigai adanya infeksi bakteri, sebagian besar bahan yang diserahkan harus
dihapus pada gelas obyek dan diwarnai gram kemudian diperiksa secara mikroskopik. Pada
pemeriksaan mikroskopik, reaksi gram dan morfologi bakteri harus diperhatikan. Terlihatnya
bakteri pada apusan pewarnaan gram tidak berarti dapat melakukan identifikasi sampai spesies.
Beberapa bakteri gram positif tak hidup dapat terpulas secara gram negatif. Biasanya, morfologi
bakteri ditetapkan dengan menggunakan organisme yang ditumbuhkan pada agar. Namun,
bakteri dalam cairan atau jaringan tubuh dapat mempunyai morfologi yang sangat beragam.
Dinding sel yang tebal pada gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena
terjadinya dehidrasi menyebabkan pori-pori dinding sel menutup, sehingga mencegah larutnya
kompleks ungu Kristal yodium pada langkah pemucatan, sedangkan sel-sel gram negatif
mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut
dalam alkohol aceton. Larutnya lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram
diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan
berlangsung lebih cepat.
Faktor-faktor lain yang juga menimbulkan keragaman dalam reaksi gram:
1. Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan.
2. Kerapatan sel pada olesan.
3. Konsentrasi dan umur-umur reagen yang digunakan untuk pewarnaan gram.
4. Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang digunakan.
5. Sejarah biakan.
 JURNAL PRAKTIKUM
Judul : Pengecatan Gram
Metode : Gram stain
Tujuan : Untuk menentukan kuman gram positif dan gram negatif
Prinsip :
Kuman gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding sel oleh pencucian
dengan alkohol, protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks ungu
Kristal iodium dipertahankan dan sel tetap ungu. Sedangkan kuman gram negatif melarutkan
zat lipid selama pencucian dengan alkohol, pori-pori pada dinding sel membesar sehingga zat
warna yang sudah diserab mudah dilepas, kemudian mengambil zat warna merah dari fuchsin.

Cara Kerja : METODE GRAM STAIN

 Buat sediaan kuman dan fiksasi.

 Diwarnai dengan gentian violet selama 3 menit, cuci dengan air mengalir.
 Diwarnai dengan lugol selama 1 menit, cuci dengan air mengalir.
 Digenangi dengan alkohol 96% sampai zat warna larut, cuci dengan air mengalir.
 Diwarnai dengan fuchsin selama 2 menit, cuci dengan air mengalir.
 Keringkan dan periksa dibawah mikroskop.

Cara Kerja : MODIFIKASI HUCCER

 Buat sediaan kuman dan fiksasi.

 Diwarnai dengan Kristal violet ammonium oksalat 1 menit, cuci dengan air mengalir.
 Diwarnai dengan lugol selama 1 menit, cuci dengan air mengalir.
 Digenangi dengan acetone alkohol sampai zat warna larut, cuci dengan air mengalir.
 Diwarnai dengan safranin selama 30 detik, cuci dengan air mengalir.
 Keringkan dan periksa dibawah mikroskop.

Hasil Pengamatan :
Bentuk : …………………………
Susunan : ……………………………
Warna : ……………………………
Sifat : ……………………………
Perbesaran : ……………………………

Interpretasi Hasil : Gram positif : kuman berwarna ungu

Gram negatif : kuman berwarna merah
 PENGECATAN SPORA

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka, maka
pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora lazim disebut sebagai endospora ialah
karena spora itu dibentuk di dalam sel. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang
buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah, jika
selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru.
Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar, korteks, dan inti yang
mengandung struktur nukleus. Apabila sel vegetatif membentuk endospora, sel ini membuat
enzim baru, memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata
lain sporulasi adalah bentuk sederhana differensiasi sel, karena itu proses ini diteliti secara
mendalam untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi.
Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel
yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa.
Dinding spora relatif tidak dapat ditembus, ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora
setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel
vegetatif. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora biasanya diwarnai dengan
hijau malachit atau carbol fuchsin.
Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong, atau silindris. Berdasarkan letaknya spora di
dalam sel kuman, dikenal letak sentral, subterminal, dan terminal. Ada spora yang garis
tengahnya lebih besar dari garis tengah sel kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel
kuman.
 JURNAL PRAKTIKUM

Judul : Pengecatan Spora

Metode : Klein
Tujuan : Untuk melihat spora bakteri
Prinsip :

Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan

agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori
kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun
dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin
dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.

Cara Kerja : METODE KLEIN

 Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.

 Dipanaskan selam 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oC selama 10 menit.
 Dibuat sediaan dan dikeringkan.
 Dimasukkan ke dalam H2SO4 1% selama 2 detik.
 Dimasukkan ke dalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.
 Sediaan dicuci dengan air.
 Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.
 Diperiksa di bawah mikroskop.

Hasil Pengamatan :
Bentuk : ……………………………
Susunan : ……………………………
Warna : ……………………………
Sifat : ……………………………
Perbesaran : ……………………………

Interpretasi Hasil : Spora : warna merah

Badan bakteri : warna biru
Judul : Pengecatan Spora
Metode : Wirtz Conklin
Tujuan : Untuk melihat spora bakteri
Prinsip :

Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan

agar pori-pori membesar zat warna malachiete green dapat masuk, dengan pencucian
pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna malachiete green tidak dapat
dilepas, sedangkan pada badan bakteri warna malachiete green dilepaskan dan
mengambil warna merah dari safranin.

Bahan/reagen :

Solotio malachiete green

- malachiete green 5 gr
- aquades 100 ml
Solotio safranin
- safranin 0,5 gr
- aquades 100 ml

Cara Kerja : METODE WIRTZ CONKLIN

 Dibuat sediaan dan dikeringkan.

 Digenangi dengan solotio malachiete green, panaskan sampai keluar uap selama 3-6
menit.
 Sediaan dicuci dengan air.
 Digenangi dengan solotio safranin selama 30-60 menit.
 Dicuci dan dikeringkan.
 Diperiksa di bawah mikroskop.

Hasil Pengamatan :
Bentuk : ……………………………
Susunan : ……………………………
Warna : ……………………………
Sifat : ……………………………
Perbesaran : ……………………………
Interpretasi Hasil : Spora : warna hijau
Badan bakteri : warna merah

Kesimpulan :