Klik untuk mengedit gaya judul Master

Isolasi dan
Identifikasi Virus
drh. Srut i List ra Adrenal in, M.Sc.

8 April 2020
Klik untuk mengedit Isolasi Virus gaya judul
master

• Tidak seperti bakteri, virus membutuhkan sel inang hidup untuk replikasi •
parasit obligat intraseluler.
• Isolasi virus tetap menjadi "standar emas" yang harus dibandingkan dengan metode
yang lebih baru.
• Ada kesenangan dalam mengisolasi virus.
Isolasi Virus
Klik untuk mengedit gaya judul Master ...

• Virus dapat tumbuh in vivo ( dalam seluruh organisme, tumbuhan, atau hewan yang hidup)
atau in vitro ( di luar organisme hidup dalam sel di lingkungan buatan, seperti tabung reaksi,
labu kultur sel, atau lempeng agar).
• Budidaya virus hewan penting untuk:
1. identifikasi dan diagnosis virus patogen secara klinis
spesimen.
2. produksi vaksin.
3. studi penelitian dasar.
Isolasi Virus
Klik untuk mengedit gaya judul Master ...

• Virion dalam media cair dapat dipisahkan dari sel inang dengan sentrifugasi atau
filtrasi.
Isolasi Virus
Klik untuk mengedit gaya judul Master ...

Keuntungan Kekurangan
'Tangkap semua' (selama mungkin dalam garis Hanya mendeteksi virus yang 'layak'.

sel yang dipilih).

Peka. Lambat (kultur sel konvensional).

Menghasilkan isolat untuk studi lebih lanjut, Diperlukan beberapa baris sel.
misalnya fenotip.
Dapat disesuaikan untuk hasil yang lebih cepat. Padat karya dan membutuhkan Staf yang terampil.

Masalah keamanan, keamanan laboratorium.

Isolasi Virus
Klik untuk mengedit gaya judul Master ...

Stadion / fase Virus dalam spesimen Deteksi antibodi

Inkubasi Ya (jarang) Tidak
awal kejadian Ya Ya (jarang)
Fase akut Ya Ya

Penyembuhan Ya (jarang) Ya

Mati Ya Tidak
...
KlikIsolasi Virus gaya judul Master
untuk mengedit

Tuan Asli Hewan Coba TAB Budaya sel

Keuntungan Paling baik Lebih praktis Penanganan Lebih luas (dapat
praktis dipilih jenis sel yang
sesuai)

Kerugian Pemeliharaan Terbatas Tidak semua virus Mahal

sulit, mahal dapat tumbuh
Klik untuk
master untuk
mengedit
Diagnosis
Spesimen
Virus gaya judul
Klik untuk
Isolasi danmengedit
Identifikasi
Gaya
Virus
judul Master

metode Spesimen / Temuan Karakteristik

Isolasi virus dalam sel yang dikultur
Jaringan, sel, sekresi, ekskresi / Spesimen
diinokulasi ke dalam kultur sel yang sesuai
dan keberadaan virus terdeteksi oleh
berbagai metode, biasanya metode
imunologi
Relatif lambat, mahal, dan teknis menuntut. Namun,
ini adalah satu-satunya metode yang menyediakan
isolat virus untuk pengujian lebih lanjut (misalnya,
pengetikan strain) dan oleh karena itu banyak
digunakan di pusat rujukan

Isolasi virus pada hewan
Jaringan, sel, sekresi, ekskresi / Spesimen
diinokulasi ke dalam hewan, biasanya tikus yang
baru lahir atau berusia 3 minggu, biasanya
dengan rute intraserebral atau intraperitoneal,
dengan penyakit atau kematian sebagai indikasi
pertumbuhan virus. Identifikasi virus dengan
berbagai metode, biasanya metode imunologis
Bahkan lebih lambat, lebih mahal, dan secara teknis
menuntut daripada isolasi virus dalam kultur sel. Namun,
untuk virus yang tidak tumbuh baik dalam kultur sel, ini
adalah satu-satunya metode yang menyediakan isolat
virus untuk pengujian lebih lanjut (misalnya, pengetikan
strain) dan oleh karena itu masih digunakan di `pusat
referensi dalam keadaan khusus
Deteksi dan Identifikasi
Klik untuk mengedit Antigen Viral
gaya judul Master

metode Spesimen / Temuan Karakteristik

Metode immunoassay enzim (misalnya, Jaringan, sel, sekresi, ekskresi / Reaksi antigen Cepat, sensitif, dan spesifik. Metode yang paling umum
immunoassay enzim penangkap antigen). virus dengan antibodi yang diketahui spesifik. digunakan saat ini.

Imunokromatografi, alat pengikat Darah, sekresi, ekskresi / Antigen virus Cepat, sensitif, spesifik, cocok untuk menguji spesimen
imunogold (setara dengan tes diidentifikasi melalui reaksi dengan antibodi individu dalam pengaturan klinis.
kehamilan di rumah). yang diketahui spesifik.

Imunofluoresensi. Jaringan dan sel / Antigen virus yang diidentifikasi in situ Cepat, sensitif, dan spesifik. Pelokalan antigen dalam sel
melalui reaksi dengan antibodi yang diketahui spesifik. tertentu menambah kepercayaan dalam diagnosis; secara
teknis menuntut.

Imunohistokimia (pewarnaan Jaringan dan sel / Antigen virus yang Lambat, tetapi sensitif dan spesifik. Pelokalan antigen dalam
imunoperoksidase). diidentifikasi in situ melalui reaksi dengan sel tertentu menambah kepercayaan dalam diagnosis;
antibodi yang diketahui spesifik. keahlian teknis yang terlibat lebih seperti perpanjangan
histopatologi.

Mikroskopi imununoelektron. Jaringan, sel, sekresi, ekskresi / Karakter dan Perpanjangan mikroskop elektron diagnostik. Cepat,
agregasi virus oleh antibodi spesifik yang sensitif, dan spesifik. Mahal dan secara teknis menuntut;
dikenal spesifik. keahlian tidak tersedia di banyak pengaturan
Klik untuk
Kultur Sel mengedit gaya judul

• Satu virion yang dapat hidup hadir dalam spesimen dapat ditanam dalam sel-sel yang dikultur, sehingga
meluasnya jutaan kali lipat untuk menghasilkan bahan yang cukup untuk dikarakterisasi secara antigenik.

• Kultur adalah satu-satunya metode menghasilkan pasokan virus hidup untuk pemeriksaan lebih
lanjut, seperti variasi antigenik.
• Untuk menghasilkan antigen diagnostik dan antibodi monoklonal untuk distribusi ke laboratorium
lain.
• Sel primer yang berasal dari jaringan janin dari spesies yang sama biasanya memberikan
substrat kultur sel yang paling sensitif untuk isolasi virus.
• Garis sel kontinu berasal dari spesies homolog (Garis sel menawarkan beberapa keuntungan
dan tersedia untuk sebagian besar mamalia domestik).
Kultur Sel mengedit gaya judul Master ...
Klik untuk

• Budaya sel:
• Kultur sel primer
• Kultur sel sekunder
• Garis sel kontinu

• Pertumbuhan virus deteksi:

• CPE (efek sitopatik): perubahan morfologis sel biakan
• Hemaglutinasi
• Hemadsorbtion
• Fenomena interferensi (virus non-CPE)
• Transformasi sel (virus onkogenik)
Klik untuk mengedit gaya judul Budaya
Monolayer

• Sel-sel yang tumbuh monolayer, melekat di dasar tabung perbenihan.

• Perbenihan sel primer (Kultur Sel Primer)
• Menggunakan organ segar (jaringan embrio, organ hewan / manusia, tumor)
• Tidak dapat dibuat subkultur.

• Garis Sel Continous

• Biakan sel ganas / tumor sehingga mudah untuk dibuat subkultur berseri tak terhingga.

• Contoh: sel Hela (dari jaringan Ca-serviks uteri); Sel Vero (ginjal kera); BHK21 (ginjal anak
hamster).
• Tidak untuk pertumbuhan virus dalam pembuatan vaksin karena akan mengalihkan
faktor karsinogenik pada resipien vaksin).
Klik untuk mengedit gaya judul Master

Derivasi garis sel

kontinu dari sel manusia
dan hewan
Klik untuk mengedit gaya judul Master

Sel untuk kultur

disiapkan dengan
memisahkan
mereka dari
matriks jaringan
mereka
Klik untuk
Kultur Sel mengedit gaya judul Master ...

• Jenis khusus kultur sel dan organ digunakan untuk virus tertentu • beta dan
gammaherpesvirus • dapat dipulihkan dari kultur monolayer yang diperbanyak
langsung dari jaringan yang diambil dari hewan yang sakit.

• Coronavirus dan Rhinovirus • pertumbuhan dapat terjadi pada kultur eksplan (mis., kubus
kecil jaringan dengan epitel utuh yang diambil dari trakea atau usus).

• Kultivasi jaringan eksplan dengan sel monolayer • virus latensi.

• Sel Arthropoda • Arbovirus.

Klik untuk
Isolasi Virus
mengedit
pada Hewan
judul gaya Master

• Banyak virus akan tumbuh dengan memuaskan pada embrio ayam atau tikus yang baru lahir tetapi tidak ada
yang sekarang umum digunakan karena kultur sel umumnya merupakan pilihan yang lebih sederhana.

• Tikus • virus arbovirus dan rabies • < Umur 24 jam disuntikkan secara intraserial dan /
atau intraperitoneal • diamati hingga 2 minggu (tanda-tanda patognomonik) • eutanasia
(histopatologi, imunofluoresensi, imunohistokimia, atau serologi).

• Hewan inang alami • penelitian patogenesis dan imunitas.

Klik untuk
master di Embrio
mengedit
Cewek
Isolasi Virus gaya judul

• Untuk banyak virus unggas.

• Ada beberapa patogen penting yang mereplikasi jauh lebih baik dalam telur daripada dalam
kultur sel yang berasal dari jaringan embrio ayam.
• Banyak virus memiliki tropisme jaringan, dan karenanya harus dimasukkan ke dalam
situs spesifik untuk pertumbuhan.
• Diinokulasi dalam rongga amniotik, rongga alantoik, kantung kuning telur, atau pada
membran korioallantoik.
• Infeksi virus dapat merusak membran jaringan, menghasilkan lesi yang disebut cacar;
mengganggu perkembangan embrio; atau menyebabkan kematian embrio.
Klik untuk mengedit gaya judul Master
Klik untuk mengedit gaya judul Master
Klik untuk mengedit Virus Pox style judul
master

Lesi cacar di seluruh 6 hari setelah inokulasinya

tubuh bercak putih di membran
chorioallantois
Klik untukInfeksi
Bronkitis mengedit gaya judul Master

• Embrio kerdil
• Amnion & allantois
menebal
• Kantung kuning telur tidak terserap
Klik untukNewcastle
Penyakit mengedit judul gaya Master

Kongesti dan hemoragi

jaringan SC.
Isolasi Virus
Klik untuk di Embrio
mengedit Cewek
gaya judul Master ...

• Hentikan virus di TAB • tanpa perubahan / dengan perubahan embrio • sifat

keganasan virus pada embrio (kematian, perdarahan, cacat, lesi).
Klik untuk
Master of amengedit
Virus Deteksi gaya judul

• CPE: kelainan sel yang dapat diamati berbeda karena infeksi virus •
Jenis atau tingkat keparahan CPE tergantung pada jenis virus yang terlibat:

1. hilangnya kepatuhan pada permukaan wadah.

2. perubahan bentuk sel dari rata menjadi bulat.

3. penyusutan nukleus.
4. vakuola dalam sitoplasmfusi membran sitoplasma dan
pembentukan syncytia multinukleasi, badan inklusi dalam nukleus atau
sitoplasma, dan lisis sel lengkap.
Klik untuk mengedit gaya judul Master
Poxvirus
Sitoplasma
eosinofilik merah
Paramyxovirus
muda
Syncytium dan
badan
badan inklusi
inklusi (panah)
sitoplasmik basofilik
dan
yang samar
pembengkakan sel

Virus herpes
Terdampar Adenovirus
sitoplasma (panah) Pembesaran
dan badan inklusi sel, pembulatan,
nuklir (panah dan
putus-putus) cluster seperti
anggur yang
khas
Klik untuk mengedit
Perhitungan Jumlah gaya
Virusjudul Master

• Titer virus: Jumlah virus infeksius pe unit volume

• Unit infeksius: jumlah risiko yang menyebabkan terdeteksinya efek
pada hospes.
1. Uji Kuantal
Tidak menghitung jumlah virus yang terinfeksi dalam inokulum (suspensi virus),
tetapi menentukan titer virus.

2. Uji Kuantitatif
Menghitung jumlah virus infeksi pada inoculum.
Klik untuk mengedit Gaya judul Uji
Kuantitatif

• Dapat dilakukan di kultur sel, TAB, model hewan.

• Endpoint: efek virus pada host • Rumus Reed dan Muench.
• LD 50: titer virus yang mampu menyebabkan kematian 50% rumah sakit yang diinokulasi

• Indo 50: titer virus yang mampu menginfeksi 50% rumah sakit yang diinokulasi

• TCID 50: virus titer yang mampu membentuknya CPE 50% pada kultur sel

• EID 50: titer virus yang mampu menginfeksi 50% embrio TAB yang diinfeksi
 Klik
& Muench
untuk mengedit gaya judul Master Reed

Log pengencer- Unit tes Kumulatif Kumulatif yang tidak Rasio A / Presentasi yang

sebuah virus yang Dukungan (A) menantang (B) (A + B) menantang

diinfeksi

-5 5/5 9 0 9/9 100

-6 3/5 4 2 4/6 66,7
-7 1/5 1 6 1/7 14,3
-8 0/5 0 11 0/11 0

• 50% titik akhir terletak antara pengenceran 10- 6 dan 10- 7

• Titer ditentukan berdasarkan angka kebalikan dari pengenceran virus pada titik
akhir
& Muench
Klik untuk mengedit gaya judul Master ... Reed

• 50% titik akhir terletak antara pengenceran 10- 6 dan 10- 7

• Jarak sebanding = % positif di atas 50% -50%
% pos di atas 50% -% pos. di bawah 50% = 66,7% - 50,0%

66,7% - 14,3% =
0,3
• Log pengenceran di atas 50% = -6
• Jarak sebanding = 0,3
• Faktor pengenceran = -1 (pengenceran serial 10x)
• ID log 50 = ( log pengenceran di atas 50%) + (jarak
sebanding x log faktor pengenceran) = (-6) +
(0,3 x -1)
• Indo 50 = 6,3
TCID
Klik untuk
50 mengedit gaya judul Master

Virus
12345
pengenceran

10- 3 SEBUAH v v v v v
Skoring
ay 1: tidak ada CPE 2: CPE
10- 4 B v v v
<50% 3: CPE 50% 4: CPE ±
10- 5 C v v v v
75% 5: Sel monolayer rusak
10- 6 D v v ay secara total
10- 7 E v v v v

10- 8 F
v v v v

10- 9 G
v v ay Reed & Muench
Tanpa H v v ay

virus
Klik untuk mengedit Gaya judul Uji
Kuantitatif

• Pada bakteri adalah jumlah koloni bakteri:

Bakteri ditumbuhkan pada medium • koloni diestimasikan sebagai jumlah
sel bakteri yang hidup.
• Virus: menghitung jumlah plak yang terbentuk pada kultur sel monolayer
yang diinfeksi virus • Assay Plak
• Contoh lain uji kuantitatif: uji bintik, uji pusat infeksi, uji transformasi, mikroskop
elektron.
Klik untuk mengedit Assay gaya judul
Master

• Virus CPE.
• Plaque assay menggunakan kultur sel monolayer yang konfluen, dan diinfeksi
dengan berbagai pengenceran virus, kemudian ditutup dengan media semisolid atau
padat.
• Media pada dipergunakan untuk melokalisir virus hanya di sekeliling sel.

• Visualisasi terbentuknya plak: neutral red, tetrazolium

• Plak terbentuk apabila sel yang diinfeksi mengalami lisis • zona bersih (tidak lisis
terwarnai).
Assay
Click to edit Master title style … Plaque
Assay
Click to edit Master title style … Plaque
Assay
Click to edit Master title style … Plaque

• PFU (plaque forming unit) • titer infektivitas virus (yang dihitung 10100
plak/pengenceran).
• Pfu/ml= jumlah plak x kebalikan pengenceran x kebalikan volume (ml)

• Contoh: kultur sel diinfeksi 0,1 ml virus dengan pengenceran 10- 5,

diperoleh rerata jumlah plak yang terbentuk 45
• Titer virus= 45 x 10 5 x 10
= 4,5.10 7 pfu/ml
Click to edit
Detection Master title style
of Virus-Specific Ag-Ab

1. Hemaglutination (HA)
2. Hemaglutination Inhibition (HI)
3. Agar Gel Presipitation Test (AGPT)
4. Complement Fixation Test (CFT)
5. Virus Neutralization (VN)
6. Enzim Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
7. Immunohistochemistry (IHC)
Click to edit Master title style Sample

• Serum, plasma, fluids.

• Antibodies in serum are very stable.
Click to edit Master
Hemaglutination (HA)
title style

• HA: viruses (ag) & RBC are mixed.

• Advantages: simple, inexpensive, available instruments, results within a few hours,
well established in many laboratories around the world, allowing some measure of
credibility, comparison, and standardization.
Hemaglutination (HA)
Click to edit Master title style …

• Untuk mengetahui titer virus • uji HI.

• Mengidentifikasi virus yang memiliki hemagglutinin.
Click to edit Master
Hemaglutination Inhibition
title style
(HI)

• Titer serum HI: The highest dilution of serum (Ab) that prevents
hemagglutination.
Click to edit Master title style
Click to edit Master
Presipitation Test (AGPT)
title style Agar Gel

• Prinsip :
1. Reaksi antara Ag dan Ab dapat berlangsung dalam lapisan agar.
2. Ag/Ab di dalam agar akan berdifusi ke segala arah & pd titik
pertemuannya akan membentuk kompleks Ag – Ab yg mengendap sebagai garis
presipitasi.
Presipitation Test (AGPT)
Click to edit Master title style … Agar Gel

• Manfaat:
1. Menentukan adanya Ag atau Ab secara kualitatif atau semi
kuantitatif.
2. Mengetahui adanya reaksi silang/ hubungan imnologik dari
beberapa macam Ag.
Click to edit Master
Neutralization (VN) title style Virus

• Prinsip: Virus menjadi non infektif bila digabungkan dgn Ab spesifik thd virus tsb.

• Kegunaan:
1. Untuk identifikasi virus.
2. Untuk mendeteksi reaksi silang di antara bbrp strain virus.
3. Untuk membandingkan level Ab dlm serum pd stadium akut dan
konvalesen.
Neutralization (VN) title style … Virus
Click to edit Master

• Hasil berdasarkan:
1. Angka kesakitan / kematian hewan coba.
2. Angka kecacatan / kematian embrio.
3. Adanya kerusakan sel (CPE) pd kultur sel.
4. Hitung dgn Rumus Reed and Muench atau Spearman-Karber.
5. Indeks Netralisasi (IN) = log titer serum standard – log titer serum uji
(Signifikans bila >log 1,5).
Neutralization (VN) title style … Virus
Click to edit Master
Click to edit Master
Complement Fixation
title
Test
style
(CFT)
Click to
Enzim edit Master
Linked title styleAssay (ELISA)
Immunosorbent

• Sbg detektor digunakan enzim

untuk melabel Ab/ Ag.

• Reaksi dpt dibaca dgn

penambahan substrat dan
ntuk melihatnya diperlukan

spektrofotometer (ELISA
reader)
Click to edit Master title (IHC)
Immunohistochemistry style

• Pemeriksaan untuk mengukur kadar ab/ ag

dalam sediaan jaringan.
• Tujuan: mengidentifikasi komponen jaringan
yang memiliki ciri tertentu dengan
menggunakan interaksi antara antigen target
dan antibodi spesifik yang diberi label.
Click to edit Master title style

Thank You
Click to edit Master title style
Click to edit Master title style
References

• MacLachlan, N.J., Dubovi, E.J. 2016. Fenner’s Veterinary Virology 5 th Edition.

Academic Press is an Imprint of Elsevier.
• Murphy, F.A., Gibbs, E.P.J., Horzinek, M.C., Studdert, M.J. 1999. Veterinary
Virology 3 rd Edition. Academic Press.
• Tim Dosen Mikrobiologi dan Imunologi. Isolasi dan Identifikasi Virus (PPT). Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya, Malang.
• Zuckerman, A.J., Banatvala, J.E., Schoub, B.D., Griffiths, P.D., Mortimer, P.
2009. Principles & Practice of Clinical Virology 6 th
Edition. Wiley-Blackwell.