PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

“PEWARNAAN SEDERHANA DAN DIFERENSIAL”

Nama : Sekar Ayu Dwi Deewanti

NIM : A1C419094

Kelas : Reguler A

Ruangan : R-001

Dosen Pengampu :

1. Dra. Harlis, M. Si.

2. Retni Sulistiyoning B, S. Pd., M. Si.

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS JAMBI

2021
I. Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini ialah agar mahasiswa terampil dalam
melakukan pewarnaan sederhana untuk membandingkan bentuk dan
pengelompokkan bakteri selanjutnya dapat ditelusuri kekerabatannya. Dan
juga agar mahasiswa mampu mengidentifikasi bakteri berdasarkan
kemampuan sel untuk bereaksi terhadap zat warna pada pewarnaan
diferensial.
II. Landasan Teori
1. Pewarnaan
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana
(simple stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan
khusus (special strain). Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik
lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis,
atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau
bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan
pengecatan struktural hanya bisa mewarnai satu bagian dari sel sehingga
dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini
adalah pengectan endospora, flagela dan pengecatan kapsul (Putri dkk,
2017:313).
2. Pewarnaan Sederhana
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Pewarnaan
sederhana adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna tunggal. Pewarna
tunggal yang biasanya digunakan dalam pewarnaan sederhana adalah
Methylene Blue, Basic Fuchsin, dan Crystal Violet . Semua pewarna tersebut
dapat bekerja dengan baik pada bakteri karena bersifat basa dan alkalin
(kromoforiknya bermuatan positif), sedangkan sitoplasma bakteri bersifat
basofilik (suka terhadap basa) sehingga terjadilah gaya tarik antara
 komponen kromofor pada pewarna dengan sel bakteri, hal tersebut
menyebabkan bakteri dapat menyerap pewarna dengan baik. Pewarnaan
sederhana bertujuan untuk memberikan kontras antara bakteri dan latar
belakang. Pewarnaan sederhana dilakukan ketika kita ingin mengetahui
informasi tentang bentuk dan ukuran sel bakteri (Putri dkk, 2017:313-314).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang
disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat terjadi
karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga
pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka
sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh
pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin, dll.
Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga
akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan
terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilen biru, kristal violet,
safranin, dan lain-lain. Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan
satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana
(Yusmaniar dkk: 2017: 23).
3. Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan diferensial, menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari
satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri
gram positif dan gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula,
spora, dan nucleus (Putri dkk, 2017:314).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram
positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
 tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumonia (Rahayuningtyas dkk, 2017:142).
Menurut Bulele et al (2019:34) Pada pewarnaan Gram terdapat 2 jenis
bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif. Tujuan dari pewarnaan Gram
ini yaitu untuk mempermudah melihat bakteri secara mikroskopik,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, melihat struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, dan menghasilkan sifat-sifat fisik serta kimia
khas dari bakteri dengan zat warna. Dalam pewarnaan, bakteri Gram positif
berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif
memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah
pewarnaan dengan kristal violet, poripori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna ungu
(Yusmaniar dkk, 2017:30).
III. Metode Kerja
3.1 Alat dan Bahan
Adapun alat dan bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini ialah :
3.1.1 Alat
1. Bunsen,
2. jarum ose,
3. mikroskop,
4. kertas lensa,
5. bak pewarna,
6. objek glass,
7. pipet tetes
3.1.2 Bahan
1. Reagen metilen biru,
 2. Reagen tinta cina/nigrosin
3. safranin,
4. kristal ungu dan carbol fuchin,
5. biarkan bakteri umur 24 jam
6. alcohol
7. lugol
8. akuades
3.2 Prosedur Kerja
Langkah-langkah kerja yang harus dilakukan di praktikum ini
yaitu :
A. Pewarnaan Sederhana

Bahan Pewarnaan Positif

Disiapkan beberapa olesan tipis mikroba menggunakan jarum

inokulasi pada objek glass bersih dan difiksasi

Diletakkan sediaan di atas bak pewarnaan, genangilah dengan

satu cat pewarna dengan selang waktu yang berbeda pada
masing-masing objek glass yang berbeda - Metilen biru 1-2 menit
- Safranin 15-30 detik - Karbofuchin 3-10 detik - Kristal ungu 2-
60 detik

Dicucilah kelebihan cat pewarna secara hati-hati

Dikeringkanlah objek glass dengan kertas hisap/tissue dengan

cara menempelkan kertas tissue jangan menggesek permukaan
apusan mikroba

Dilihatlah dibawah mikroskop dimulai dengan pembesaran

terkecil hingga pembesaran terbesar. Saat pembesaran terbesar
gunakan minyak emersi.

Digambar hasil pengamatan.

Hasil
 Bahan Pewarnaan Negatif

Dieteskan tinta cina/nigrosin pada objek glass

Ditambahkan sejumlah inokulan dan aduklah dengan rata

Diambillah satu objek glass bersih, lalu letakkan ujungnya dengan

kedudukan miring dipinggir tetesan zat pewarna yang telah
diinokulasikan bakteri

Didoronglah objek glass yang bersih tadi di atas permukaan objek glass
yang berisi inokulan hingga tersebar merata membentuk apusan tipis,
lalu biarkan kering di udara

Dilihatkah di mikroskop mulai dari pembesaran kecil hingga pembesaran

besar. Saat pembesaran terbesar gunakan minyak emersi

Digambar hasil pengamatan

Hasil

B. Pewarnaan Diferensial

Bahan Pewarnaan Gram

Diambil kaca obyek yang bersih.

Dibagian atas kaca obyek tersebut diteteskan setetes akuades atau larutan
garam fisiologi dengan menggunakan loop

Ditambahkan pada setetes air tersebut bakteri yang akan diamati dan
sebarkanlah hingga merupakan lapisan yang rata selebar ± 1 cm.

Dibakar diatas Bunsen Jarum ose yang dipakai mengambil bakteri dari
perbenihan murni

Dikeringkan di udara apusan tersebut (pengeringan dapat di percepat

dengan melakukan di atas nyala bunsen berkali–kali).

Difiksasi dengan jalan melewatkan melalui nyala api, setelah kering

Digenangi apusan dengan pewarna gentian violet selama satu menit.

Dicuci dalam air. Tambahkan larutan Lugol pada apusan tersebut,

biarkan selama satu menit.

Dibilas dengan alkohol selama 30 detik.

 Diwarnai dengan larutan Safranin selama 1 menit. Cuci dalam air.

Dikeringkan di udara atau melalui nyala api.

Hasil

IV. Hasil dan Pembahasan

4.1 Hasil
Adapun hasil yang didapatkan dalam percobaan ini termuat
dalam table sebagai berikut :

No Keterangan Gambar

1.

Pewarnaan positif,
menggunakan crystal violet,
terdapat banyan bakteri
berbentuk cocus, warna yang
terlihat violet

Veibrita dkk, 2015: 3

2. Pewarnaan negatif,
menggunakan nigrosin,
terdapat banyak bakteri
berbentuk batang dan
berwarna putih. Latar
belakang berwarna gelap

Veibrita dkk, 2015: 3

3. Pewarnaan gram positif,
koloni berwarna ungu,
berbentuk bulat/kokus

Jannah, 2017:563

4 Pewarnaan gram negatif,

menunjukkanbakteri berbatang
pendek dan berwarna merah
setelah pewarnaan.

Rahayu dkk, 2017:53

4.2 Pembahasan
Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau
olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau
bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial.
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling
banyak digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup
sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga tranparan dan
sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu
teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamat. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
 Pada percobaan ini, pewarnaan yang dilakukan yaitu pewarnaan
sederhana dan diferensial, berdasarkan literature yang dibaca, sebelum
dilakukan pewarnaan, maka sel-sel bakteri harus terlebih dahulu difiksasi
pada gelas objek, jika sel-sel tidak difiksasi maka lapisan sel yang akan
diwarnai dapat tercuci selama prosedur pewarnaan.
Pewarnaan sederhana yang dilakukan di praktikum ini yaitu
pewarnaan positif dan pewarnaan negatif. Data hasil yang didapatkan
berdasarkan jurnal penelitian tentang pewarnaan sederhana. Pada data
hasil dapat dilihat di pewarnaan positif, terdapat bakteri berbentuk kokus,
warna yang terlihat yaitu ungu, karena reagen yang digunakan yaitu
crystal violet, berdasarkan literature yang dibaca, yaitu menurut Veibrita
dkk (2015:3) Crystal violet dipakai sebagai zat warna primer
dikarenakan mampu melekatkan bakteri pada kaca dan mencegah
autolisis pada sel, membuat sel-sel lebih kuat atau keras, mencegah
mengkerutnya globula-globula protein sel, mempertinggi sifat reaktif
gugusangugusan, membunuh bakteri secara cepat dengan tidak
mengubah bentuk dan strukturnya dan mengubah afinitas cat. Pada
pewarnaan negatif, terlihat bentuk bateri berbentuk batang dengan warna
putih dan latar belakang berwarna hitam, yang disebabkan oleh pewarna
nigrosin yang dipakai. Pewarnaan sederhana dilakukan ketika kita ingin
mengetahui informasi tentang bentuk dan ukuran sel bakteri.
Berdasarkan literature yang dibaca, yaitu menurut Yusmaniar dkk,
(2017: 23) Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion
antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna
yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik
baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan asam dan pewarna basa. Pewarna asam
dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam
kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan
negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak
oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut
pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan
nigrosin, asam pikrat, eosin, dll. Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa
pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri
dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa
misalnya metilen biru, kristal violet, safranin, dan lain-lain. Teknik
pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa
pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana.
Pada pewarnaan diferensial, didapatkan hasil pada pewarnaan
gram positif, koloni berwarna ungu, berbentuk bulat/kokus, padabakteri
yang termasuk gram positif, pada pewarnaan gram akan
mempertahankan warna crystal violet yang digunakan sebagai pewarna
primer. Pada pewarnaan gram negatif, didapatkan hasil bakteri berbatang
pendek, dan berwarna merah setelah pewarnaan, hal ini terjadi karena
pada bakteri gram negatif akan mengalami kehilangan warna saat
pewrnaan, sehingga sel-selnya akan menyerap pewarna tandingan. Hal
ini sejalan dengan hasil penelitian Jannah, dkk (2017:563) Pewarnaan
Gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan
bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan struktur, komposisi
dinding sel bakteri dan permeabilitas diantara kedua kelompok dinding
sel bakteri menyebabkan perbedaan warna pada bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif. Pewarnaan Gram berdasarkan kemampuan bakteri
untuk menahan pewarna primer (kristal ungu) atau kehilangan warna
primer dan menerima warna tandingan (safranin). Bakteri Gram positif
akan menunjukkan warna ungu sedangkan untuk bakteri Gram negatif
akan menunjukkan warna merah.
Dalam proses pewarnaan gram, terdapat pembilasan dengan
alcohol yang dilakukan selama 30 detik. Penambahan alkohol pada
bakteri Gram positif menyebabkan pori-pori dalam peptidoglikan
menjadi menyusut sehingga kristal violet melekat, terlarut atau luntur
oleh alkohol yang mengakibatkan warna bakteri Gram positif adalah
violet, sedangkan pada bakteri negatif lipid pada membran luar larut dan
lepas sehingga safranin atau zat warna pendamping diikat yang
menyebabkan warna bakteri Gram negatif menjadi merah. Hal ini sejalan
 dengan penelitian yang dilakukan Rahayu dkk (2017:53) Pada sel Gram
negatif, alkohol meningkatkan porositas dinding sel dengan melarutkan
lipid lapisan luar. Jadi, kompleks Kristal Violet (KV-I) dapat lebih
mudah dihilangkan dari lapisan peptidoglikan yang tidak tertaut silang
dengan kuat. Oleh sebab itu, efek pencucian alkohol memfasilitasi
pelepasan kompleks KV-I yang tidak terikat, yang membuat selsel
menjadi kehilangan warna atau tidak berwarna. Karena hanya sel-sel
Gram negatif yang mengalami kehilangan warna sehingga sel-selnya
menyerap pewarna tandingan. Sedangkan Gram-positif mempertahankan
warna ungu dari pewarna primer.
V. Penutup
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan dari praktikum yang telah dilakukan, dapat
disimpulkan bahwa, pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang
bertujuan untuk memberikan kontras antara bakteri dan latar belakang.
Pewarnaan sederhana dilakukan ketika kita ingin mengetahui informasi
tentang bentuk dan ukuran sel bakteri. Terdapat dua jenis pewarnaan
sederhana, yaitu pewarnaan positif dan negatif. Pada pewarnaan
diferensial yang dilakukan yaitu pewarnaan gram, untuk menentukan
bakteri jenis gram positif dan gram negatif, bakteri gram positif akan
berwarna ungu sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah
setelah pewarnaan.
5.2 Saran
Adapun saran yang dapat diberikan yaitu, untuk selalu menjaga
kebersihan, dan keselamatan selama proses praktikum berlangsung.
 DAFTAR PUSTAKA

Bulele, T., Rares., F. E. S., Porotu’o, J. 2019. ‘’ Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan
Gram pada Penderita Infeksi Mata Luar di Rumah Sakit Mata Kota Manado’’.
Jurnal e-Biomedik (eBm). 7(1): 30-36.

Jannah, R., Safika., Jalaluddin, M., Darmawi., Farida., Aliza, D. 2017. ‘’ JUMLAH
KOLONI BAKTERI SELULOLITIK PADA SEKUM AYAM KAMPUNG
(Gallus domesticus)’’. JIMVET. 01(3): 558-565.

Putri, M., Sukini., Yodong. 2017. Mikrobiologi. Jakarta: Kementrian Kesehatan

Republik Indonesia.

Rahayu, S.A., dan Gumilar, M.H. 2017. ‘’ UJI CEMARAN AIR MINUM
MASYARAKAT SEKITAR MARGAHAYU RAYA BANDUNG DENGAN
IDENTIFIKASI BAKTERI Escherichia coli’’. IJPST. 4(2): 50-56.

Rahayuningtyas, A.D., Dewi, W., Indrati. 2017. ‘’ Pemanfaatan ekstrak etil asetat buah
merah sebagai zat pengganti pewarna primer pada teknik pengecatan tunggal
bakteri gram negatif batang’’. J Ked Gi Unpad. 29(2); 138-144.

Veibrita, S. B., Nirmayani., Watu, T., Apriliasari, H. S. F., dan Firdha, B. P. J. 2015. ‘’
Pewarnaan dan Cara-Cara Pewarnaan’’. Jurnal Mikrobiologi Dasar. 2(5):1-4

Yusmaniar., Wardiyah,. Nida. K. 2017. MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI.

Jakarta: Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.
LAMPIRAN