LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR

MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA

NAMA : Rifki Muhammad Iqbal

NIM : 1211702067

KELAS : III B

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SUNAN GUNUNG DJATI

BANDUNG

2012
 MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA

Tanggal Praktikum : 30 November 2012

I. Tujuan Praktikum
- Melakukan pengukuran sel mikroorganisme.
- Melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count, MPN, dan
Haemotytometer.
II. Dasar Teori

Mikroorganisme adalah makhluk hidup yang mempunyai ukuran yang sangat kecil.
Untuk mengamati mikroba tidak bisa digunakan mata telanjang. Beberapa alat digunakan
untuk mengamatinya, seperti mikroskop dengan perbesaran yang beragam. Selain diamati,
mikroorganisme atau mikrobia tersebut juga dapat dihitung.Perhitungan ini diperlukan untuk
mengetahui seberapa banyak jumlah mikroba yangada di dalam sampel. Alat yang digunakan
untuk menghitung mikroba ini adalahcolony counter. Jumlah mikroorganisme dapat dihitung
melalui beberapa cara, namun secara mendasar dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu
perhitungan langsung dan tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui
beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa
memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara
tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan
perhitungan (Arya, 2008).

Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah
dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai)
dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak
langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih
hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, adabeberapa cara yaitu : perhitungan pada
cawan petri (total plate count / TPC),perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah
terkecil atau terdekat (MPNmethode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri).
Metode perhitunganMPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah
bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis
bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi
tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah
amonium menjadi nitrat (Lim, 1998).

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif
koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa
dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap.Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan
analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform
dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak
langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan
berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang
dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini. (Lay,
1994).

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai

macam penelaahan mikrobiologis. Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung
jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan
secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah
dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai)
dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak
langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih
hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada
cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah
terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri)
(Dwidjoseputro,1998).

III. Metode Praktikum

3.1. Alat dan Bahan

Alat Bahan
Mikroskop Alcohol 70 %
Cover glass Akuades
Chamber / haemochitometer Biakan bakteri
Tabung reaksi
3.2. Cara Kerja

Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)

Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 %

lalu keringkan dengan tissue.

Letakkan cover glass di atas alat hitung.

Tambahkan 50 l suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada
parit kaca pada alat hitung.

Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).

Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.

Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak.

Lukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10, apabila bertumpuk.

Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik).
IV. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
4.1. Hasil Pengamatan

Gambar Keterangan

Haemacytometer, merupakan sejenis alat

yang digunakan untuk menghitung bakteri
dalam satuan isi yang sangat kecil.

Jarum ose, merupak alat yang digunakan

untuk mengambil biakan bakteri.

Tabung reaksi, digunakan sebagai tempat

atau wadah bahan yang berisi bakteri.

Proses pemasukkan larutan Alkohol 70 %

kedalam tabung reaksi.

Proses pengambilan biakan bakteri yang

nantinya akan dimasukkan kedalam tabung
reaksi yang sudah berisi larutan alkohol 70
%.

Proses pemasukkan biakan bakteri kedalam

tabung reaksi.
 Menutup bagian atas Haemacytometer
dengan kaca penutup sebelum diisi dengan
biakan bakteri.

Proses pemasukan biakan bakteri kedalam

celah-celah Haemacytometer.

Proses identifikasi dibawah mikroskop.

4.2. Pembahasan

Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara (tidak langsung)
Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan secara langsung. Penghitungan
mikroba secara langsung antara lain:
1. Plate Count (hitungan cawan)
Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup
dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media
pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh
dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi
tersebut.
2. Turbidimetri
Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu
larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume
total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau
semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan.
Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang
gelombang 520 nm 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan
 jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran optical
density (ditentukan dengan spektrofotometer).
3. Hemasitometer
Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis.Ruang hitung terdiri dari 9
kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang
dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan
demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah
0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga
jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

Perhitungan Bakteri Secara Langsung

Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat
preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan
ruang hitung (counting chamber) (Sutedjo, 1991).

Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan menghitung

jumlahnya tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu medium, dalam teknik ini semua
sel mikroba baik yang idup maupun yang mati akan terhitung. Untuk melakukan enumerasi
mikroba dalam suatu bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat(Waluyo 2010).

Pengenceran dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah

mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan penghitungan
dapat diminimalkan.

Perhitungan Bakteri Secara Tidak Langsung

Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah

mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam
pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count /
TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN
methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991).

1. Berdasarkan kekeruhan

Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya.

Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media,
yang akan mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium.
(Waluyo, 2010).

2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count)

Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang
masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan
pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi
pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri
akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam inkubasi.
Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat colony counter
yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik. (Waluyo, 2010).

Hemasitometer
Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan
sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah.Hemasitometer pada
mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-
CharlesMalassez.
Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume
dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki persegi-persegi
kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas bagian yang
diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang tingginya 0,1
mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-5 mm3.
Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat
menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang
digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel
yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya
adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi
kontaminasi . (id.wikipedia.org).
Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-
Improved.Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu harus dibersihkan hemasitometer
dan cover glass dengan menggunakan alkohol.Hal ini dimaksudkan agar hemasitometer
bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan.Setelah dibilas dengan
alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu lensa.Pada saat pengeringan,
tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada permukaan hemasitometer.Hal ini bertujuan
agar garis-garis yang terdapat pada hemasitometer tidak hilang.Permukaan lensa objektif dan
lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan tisu
lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan kotoran yang dapat mengganggu
proses penghitungan mikroba. Pengamatan dilakukan pada perbesaran 400X.

Kelemahan Dan Kelebihan Dari Metode Perhitungan Bakteri Secara Langsung

Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan.
Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:
Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu
keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada
di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu
(misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat
membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel
mati akan menyerap biru metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna
tersebut secara enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.
Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena
ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak,
sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai
sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.
Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal
untuk bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati
harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung
Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak
mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam
perhitungan sel.
Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti
bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif
celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih
mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-
sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan
menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80
sebanyak 0,1 %.
Cara Menghitung Sel Mikroorganisme Dengan Ruang Hitung
Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan perjanjian supaya tidak
terjadi perhitungan dua kali, yaitu :
o Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang
diamati/dihitung.
o Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung.

Metode Perhitungan
Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan pertolongan
kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2 terdapat 25 buah kotak
besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Alat
haemocytometer digunakan di bawah mikroskop, sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm.
Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah
sel per mL sampel dapat dihitung sebagai berikut:
Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak
Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar (1/0,02)
Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3 sampel 103
= Jumlah sel per kotak besar 25 kotak (1/0.02)x 10^3
Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak 50 103
Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah sel
per ml sampel adalah: 12 1,25 106 = 1,5 107.

Kategori jumlah sel yang di dapat setelah melakukan praktikum adalah :

Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105
= 13 x 2,5 x 105
= 32,5 x 105

Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan jumlah mikroba ini di dapat hasil 32,5
x 105 per mili liter (ml) jumlah sel bakteri ini termasuk kedalam kategori jumlah banyak
sehingga dengan jumlah yang banyak tersebut dapat dikatakan suspensi bakteri Sarcina yang
terkontaminan E.coli ini bersifat patogen.
V. Kesimpulan

Dari praktikum tersebut dapat disimpulkan bahwa jumlah mikroba yang dihitung secara
langsung yang terlihat pada perbesaran 400x adalah 13 koloni.Pada praktikum kali ini kita
menggunakan alat Hemasitometer.Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan
untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel
yang rendah.

Aturan penghitungan bakteri dengan Haemocytometer adalah :

1. Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung.

2. Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung sel
yang didapat pada praktikum kali ini adalah 32,5 x 105 , jumlah bakteri ini termasuk kategori
jumlah banyak sehingga bakteri tersebut bersifat patogen.

Daftar Pustaka
Dwijoseputro, d. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan ; Jakarta.
Hadioetomo, R. S. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia; Jakarta.
Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada;
Jakarta.
Sutedjo.1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta ;Jakarta.
Waluyo, lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM; Malang.