I.

PENDAHULUAN

A. Judul
Enumerasi bakteri secara langsung mikroskopis metode counting chamber
(bilik hitung).

B. Latar belakang
Bakteri dapat dinggal dimana-mana atau yang kita kenal dengan
istilah kosmopolitan (tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain),
serta bakteri bersifat mikroskopis, yang hanya bisa dilihat dengan
menggunakan mikroskop, salah satunya adalah bakteri. Bakteri dapat
tumbuh dan berkembang dengan sangat pesat di alam. Bakteri merupakan
makhluk hidup yang sering ditumbuhkan dalam medium untuk tujuan
suatu penelitian. Pertumbuhan dan perkembangan bakteri berbentuk
koloni-koloni yang sulit dihitung jumlah bakterinya. Setelah mempelajari
bagaimana menumbuhkan suatu koloni bakteri, tentunya kita harus
mengetahui kuantitas dan kualitas dari bakteri tersebut. Kualitas suatu
bakteri dapat diketahui dengan melihat sifat-sifat bakteri baik yang
menguntungkan maupun merugikan. Sedangkan, untuk menentukan
kuantitas bakteri dapat dengan berbagai cara perhitungan jumlah bakteri,
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan
langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat
mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat
tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah
orgnisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus
memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan.
Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara
lain, adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat
sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung
(counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya
untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih
 hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu:
perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan
melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN
methode) dan metode membran filter (Carrol, 1964).
Dalam percobaan kali ini akan diinformasikan terkait cara
penghitungan langsung bakteri menggunakan mikroskop dengan metode
counting chamber (haemocytometer). Penghitungan jumlah bakteri
biasanya bertujuan untuk mengetahui banyaknya jumlah bakteri yang
mungkin ada pada suatu bahan (khususnya air / bahan makanan) yang
disimpan dengan waktu tertentu sehingga kualitas bahan tersebut dapat
diketahui atau diketahui masa dimana bahan makanan tidak boleh di
konsumsi lagi.

C. Tujuan
1. Untuk melakukan perhitungan jumlah bakteri pada sumber air/ makanan
dengan perhitungan langsung mikroskopis metode counting chamber
(Bilik Hitung).
2. Mengetahui kelebihan dan kekurangan perhitungan secara langsung
mikroskopis metode counting chamber (Bilik Hitung).
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu

media tanpa mengidentifikasi jenisnya yang bertujuan untuk menentukan jumlah
sel dari suatu sampel air / sampel makanan secara kuantitatif (Jutono, 1980).
Perhitungan secara langsung dilakukan secara mikroskopis, yaitu dengan
menghitung sel dibawah mikroskop. Setiap sel dalam suspensi (sampel cair)
dengan volume yang sangat sedikit dan telah diukur secara teliti, diukur dengan
menggunakan slide khusus yaitu kotak penghitung (counting chamber/
haemacytometer). Volume cairan yang terdapat pada tiap kotak kecil pada kotak
hitung dapat diketahui secara pasti sehingga jumlah sel dalam tiap kotak dapat
terlihat dan dihitung, jadi jumlah sel/ml larutan sel dapat diketahui (Buckle dkk,
1987).
Menurut Juntono dkk (1980), perhitungan bakteri secara langsung
Counting chamber dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel yang hidup dan
yang mati menggunakan haemocytometer dimana 1 tetes suspensi biakan bakteri
pada alat ini ditutupi dengan cover glass dan diamati dibawah mikroskop. Jumlah
sel bakteri tiap mL dapat ditentukan dengan cara menentukan jumlah dari sel rata-
rata pada tiap petak yang volumenya telah diketahui.
Hemocytometer adalah ruang kaca atau gelas yang meliliki sisi-sisi
ditinggikan dengan penutup kecil tembus cahaya yang tepat 0,1mm diatas lantai
ruang (Hansen, 2013). Cairan yang digunakan dalam perhitungan tersebut
memiliki volume tertentu, hingga gelas penutup dapat terpenuhi. Pada alat ini
terdapat 9 kotak besar dengan luas 1 mm 3, dalam 1 kotak besar ditengah terbagi
menjadi 26 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Sehingga dalam 1 kotak besar
terdapat 400 kotak kecil. Tiap ruang hitung memiliki lebar 0,1 mm, tinggi sampel
yag terletak antara gelas objek dan gelas penutup adalah 0,2 mm (Ferdiaz, 1992).
 Ga
mbar alat haemacytometer (Counting chamber)

Menurut Carol dan Freund (1964), pada haemocytometer terdapat

celah yang dipergunakan sebagai wadah untuk larutan dengan tinggi 0,1 mm,
oleh karena itu volume larutan yang dapat masuk ke celah kotak hitung besar
(counting grid) adalah 0,1 mm3. Perhitungan ini menggunakan teknik
sampling, dimana 5 kotak diambil dari 25 kotak yang ada kemudian hasil di
hitung rata-rata dan dianggap sebagai jumlah bakteri perkotak. Jumlah dari
bakteri per kotak dikalikan dengan 25, hal ini dilakukan untuk mendapatkan
jumlah bakteri per volume haemocytometer (0,1 mm-3). Volume pada
haemocytometer memiliki satuan yang dikonversi ke cm3 dengan mengalikan
1000 lalu dikalikan dengan kebalikan dari faktor pengenceran hal ini
 disebabkan pengenceran berbanding terbalik dengan jumlah bakteri. Rumus
perhitungan langsung dapat dituliskan :

1
∑ bakteri total = jumlah bakteri rata-rata × 25 × 10 × 103 × faktor pengenceran

Gambar 1. Haemocytometer (Sumber: dokumentasi pribadi)

Menurut Hadioetomo (1990), kelebihan dari metode ini :

1. Pelaksanaan perhitungan cepat
2. Peralatan yang diperlukan dalam perhitungan tidak banyak
Kelemahan metode perhitungan tidak langsung menurt Hadioetomo
(1990), yaitu :
1. Sulit menghitung sel yang berukuran sangat kecil, misalnya bakteri. Hal ini
disebabkan oleh ketebalan hemocytometer yang tidak mungkin untuk
digunakannya lensa obyektif celup minyak
2. Kecenderungan sel untuk bergerombol sehingga sukar untuk membedakan
sel-sel individu
 III. METODE

A. Alat
Alat yang dihunakan pada percobaan ini adalah bunsen, petri dish, gelas
beker, gelas penutup, haemocytometer, handcounter, inkubator, kapas, karet
gelang, kertas payung, korek api, label, laminair flow (LAF), mikropipet,
mikroskop, mikrotip, pipet ukur, pro pipet, rak tabung reaksi, tabung reaksi,
timbangan elektrik, trigalski, dan vortex.

B. Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah aquadest steril, alkohol
70%, medium NA dalam petri dish, tip, tissue, sampel tempe, sampel jamu,
sampel susu dan sampel saos.

C. Cara Kerja
1. Perhitungan langsung
a. Pengenceran sampel
Susu, jamu dan saos diambil sebanyak 0,1 ml dengan
menggunakan timbangan elektrik dan dimasukkan ke tabung reaksi yang
berisi 9,9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-2. Tabung reaksi
kemudian divortex. Susu, jamu dan saos pada pengenceran 10-2 diambil
sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian
dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril, untuk
pengenceran 10-3. Tabung reaksi kemudian di vortex. Susu, jamu dan
saos pada pengenceran 10-3 diambil sebanyak 0,1 ml dengan
menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian dimasukkan ke tabung
reaksi yang berisi 9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-4. Tabung
reaksi kemudian di vortex. Susu, jamu dan saos pada pengenceran 10-4
diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet
kemudian dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril,
untuk pengenceran 10-5. Tempe ditumbang dengan menggunakan
timbangan elektrik sebanyak 0,1 ml kemudian pengenceran sampel
dilakukan seperti pada Susu, jamu dan saos.
b. Perhitungan langsung
Haemocytometer dan gelas penutup disterilkan dengan
menggunakan alkohol 70% kemudian di panaskan diatas api bunsen.
Haemocytometer kemudian ditutup dengan mengunakan gelas penutup
dan suspensi sampel Saos, susu, tempe dan jamu dengan pengenceran 10 -
3
, 10-4, dan 10-5 diteteskan pada haemocytometer sebanyak 0,1 ml pada
kedua sisi yang berbeda. Haemocytometer diletakkan pada meja benda
kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 45 x 10.
Jumlah bakteri yang terdapat pada 5 kotak dalam bilik hitung diamati
kemudian dihitung dengan menggunakan hand counter. Cara
penghitungannya dari kiri ke kanan kemudian kebawah lalu kekiri, begitu
seterusnya. Perghitungan secara langsung dengan cara ini dilakukan juga
pada hati ayam. Rumus yang digunakan yaitu :
1
∑bakteri = ∑ bakteri rata-rata × 25×10× 103 ×
faktor pengenceran
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Beberapa faktor yang mempengaruhi penghitungan bakteri baik

secara langsung maupun secara tidak langsung, antara lain:
1. Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka
jumlah bakteri yang dikandungnya akan semakin sedikit.
2. Temperatur dan pH, berkaitan dengan temperatur dan pH optimum dari
suatu jenis bakteri.
3. Komposisi medium, medium yang digunakan untuk inokulasi harus sesuai
dengan bakteri yang akan dihitung.
4. Keterampilan dan ketelitian dalam menggunakan alat.

A. Perhitungan Langsung

Berikut ini merupakan hasil dalam praktikum penghitungan jumlah

bakteri secara langsung (menggunakan counting chamber dengan
haemocytometer)
Tabel 1. Hasil Perhitungan Langsung Jumlah bakteri pada tempe, jamu,
saos dan susu.
Kelo Rata-rata bakteri
m
Pok Sampel 10-3 10-4 10-5
1 27 21,3 39
2 Tempe 45 40 30,67
3 152,8 140,2 115
4 Jamu 152,8 140,2 115
5 44 23,5 42,6
6 Saos 57,67 23,5 42,6
7 137 129 37,3
8 Susu 83,8 35 20,2

Pada metode ini, sampel diencerkan dengan pengenceran 10-2, 10-3,

10-4, 10-5. Sebelumnya sampel yang berbentuk padatan di tumbuk terlebih
dahulu, lalu ditimbang sebanyak 1 gram, tambahkan aquades hingga
larutan menjadi 9 ml. Sampel (Tempe, jamu, susu, dan saos) di ambil
menggunakan pipet ukur sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam aquades
steril 9 mL. Semua sampel di ambil hanya 1 mL dan aquades sebanyak 9
mL dikarenakan pengenceran dilakukan lompat dari 10 menjadi 10 -2.
Larutan kemudian di vortex, Pengenceran selanjutnya dilakukan secara
berurutan sehingga larutan pengenceran sebelumnya yang diambil yaitu
1mL dan aquades steril pada tabung reaksi yaitu 9 mL, setelah itu selalu di
vortex.
Untuk mengamati jumlah sel bakteri, haemocytometer disterilkan
kemudian diletakkan gelas penutup diatasnya. Pengenceran 10-3, 10-4, 10-5
diamati secara berurutan dengan meneteskan larutan pada haemocytometer
dan diamati dibawah mikroskop. Hand counter digunakan untuk
menghitung bakteri yang dapat diamati. Pengenceran ini dilakukan untuk
memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah mikroba yang
dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan
penghitungan dapat diminimalkan. Suspensi bakteri ini diteteskan
sebanyak 1 tetes pada alat yang disebut Hemocytometer yang telah
dibersihkan dengan alkohol, hal ini dimaksudkan agar hemositometer
bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan, prinsip
dari cara pemakaian alat ini adalah dengan menempatkan 1 tetes suspensi
bakteri pada ruang hitung yang terdiri dari 9 kotak besar yang luasnya 1
mm2. Hemositometer dengan ukuran besar, 1 x 1 mm (1 mm2) ini dibagi
dalam 3 cara: 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm 2), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm2)
dan 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm2). Pusat, 0,20 x 0,20 mm ditandai, 1 x 1
mm2 yang kemudian dibagi lagi menjadi 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm 2).
Struktur sel-ukuran yang akan dihitung adalah yang terletak antara tengah
tiga baris di atas dan kanan alun-alun dan dari tiga baris di bagian bawah
dan kiri alun-alun. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume
ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat
diketahui dan dapat digunakan sebagai data dalam rumus untuk
mengetahui jumlah sel bakteri tiap ml.
Rumus yang digunakan pada perhitungan Langsung :
 1
∑ bakteri total = jumlah bakteri rata-rata × 25 × 10 × 103 × faktor pengenceran

Logika perhitungan :
a. Jumlah bakteri rata-rata : merupakan jumlah bakteri rata-rata yang dihitung
dalam lima kotak perwakilan yang diasumsikan sebagai jumlah bakteri setiap
kotak.
b. Angka 25 : setelah diketahui asumsi jumlah bakteri tiap kotak, maka asumsi
jumlah bakteri tiap kotak dikalikan 25, karena ada 25 kotak yang kita hitung
melalui perwakilan dari 5 kotak.
c. Angka 10 : berasal dari volume yang kita hitung, dengan rumus volume = p x l
x t. Panjang kotak adalah 1 mm, lebar kotak adalah 1 mm, dan ketinggian
haemocytometer dari dasar (bukan dari kanal) hingga permukaan gelas penutup
adalah 0,01 mm. Jumlah sel yang sudah kita kali di bagu dengan volume 1/10,
sehingga didapat angka perkalian dengan 10.
d. Angka 103 : berasal dari konversi mm3 dari satuan volume sebelumnya
menjadi cm3 karena cm3 = ml.
e. 1/faktor pengenceran : berdasarkan faktor pengenceran dari suspensi yang kita
gunakan.
 DAFTAR PUSTAKA

Buckle. 1987. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Carol, B., Freund, M. 1964. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm
Concentration in Human Semen. The Journal of the Society for
Dwidjoseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.
Fardiaz, S. 1992. Mikirobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama,
Hadioetomo, R. S. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia Pustaka
Utama, Jakarta.
Hansen, P. J. Counting of Bacterial Colony Forming Units for Direct Enumeration
of Viable and Total Bacteria in Drinking Water. Departement of Civil
Engineering Journal of Microbiological Methods Canada, 37 : 77-79.
Jakarta.
Jannasch, H.W., dan G.E., Jones. (1959). Bacterial Population in Sea Water as
Determined by Different Methods of Enumeration. Limnal. Oceanogr.
4:128-139.
Jutono, J., Soedarsono, S., Hartadi, S., Kabirun, S., Suhadi, D., Soesanto. 1980.
Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi
Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta.
Lay, W. B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada,
Jakarta.
Penn, C. 1991. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Purwoko, T. 2007. Fisiologi Bakteri. Bumi Aksara, Jakarta.
Rahayu, Asih. 2000. Deteksi Adanya Bakteri Pada Air Minum dalam Kemasan
Galon. Jurnal Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma.
Surabaya.
Reproduction and Fertility, 8 : 149-155.
Soetarto, E. S., Suharni, T. T., Nastiti, S. Y., Sembiring, L. 2008. Mikrobiologi.
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta.
Tomasiewicz, D. M. 1980. The Most Suitable Number Colonies On Plates for
Counting. Journal of Food Protection. 43(4) : 282-286.
Waluyo, L. 2007. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. UMM Press,
Malang.