BAB II

TINJAUN PUSTAKA

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling
utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan
dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor
yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat
warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat
juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri
tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Macam macam pewarnaan (yulneriwanti,2008):
1. Pewarnaan negatif
Bakteri tidak diwarnai tetapi mewarnai latar belakangnya
Ditujukan untuk bakteri yang sukar untuk diwarnai, sepertispirochaeta.
2. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru methylen/air fuchsin)
Tujuannya hanya melihat bentuk sel
3. Pewarnaan differensial
Menggunakan lebih dari satu macam zat warna
Tujuannya untuk membedaka antara bakteri
Contoh: pw.gram.pw. bakteri tahan asam
4. Pewarnaan khusus
 Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri, seperti kapsul,spora, flagel,
dll.(yulneriwanti,2008)

Pada dasarnya pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri, tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi gelap, zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan
mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga bakteri tampak transparan dengan latar belakang
hitam. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi latar belakngnya
menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus
pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka
terjadi penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh
dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif atau
pewarnaan asam dapat terjadi karena senyawa pewarnaan berwarna negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang
bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu dinding sel menjadi
tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam
pikrat dan eosin. Teknik ini berguna untuk menentukan moffologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-
bahan kimia, maka terjadi penyusutan dan salah satu bentuk agar penentuan sel dapat diperoleh
denagan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo,1990).

Pada pewarnaan negatif, lingkungan yang berwarna hitam disebabkan oleh pewarna yang
digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini telah sesuai
dengan pustaka yang menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif,
maka pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat
warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan
tetap berwarna bening (Alcamo,1996)

Selaini itu, disebutkan juga pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroseluler
yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif
tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan luarnya saja (entjang,2003)
II. Tinjauan Pustaka

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme
tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana
karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan
untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana
pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen
biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-
negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid)
kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna
merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.
Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi
oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan

Penghambatan oleh pewarna basa Lebih dihambat Kurang dihambat

(VK)

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif kompleks Relatif sederhana

Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan

perlakuan fisik

(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler.
Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk
mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna
tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti
asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang
sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam
prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna
itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan
oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat
diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri
tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai
mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu
kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan
asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit
kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan
methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu
larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau
tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus
:Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk
dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan
dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan
dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif,
sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop
meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil.
Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi
(Aditya, 2010)
a. Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air
dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang
berwana biru gelap.

b. Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.

c. Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

III. Alat dan Bahan

Alat :