Anda di halaman 1dari 21

Laporan Praktikum Mikrobiologi

Nama NIM Hari/Tanggal Waktu Asisten

: : : : : 1. 2.

PJP

PEWARNAAN MIKROBA ( Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Spora ) Pendahuluan Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Jawetz 2008). Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifatsifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesiesspesies bakteri yang membentuknya (Prescott 2008). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe

disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Bailey 2007). Cara pewarnaan Gram diciptakan pertama kali tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi yang bernama Christian Gram. Cara pewarnaan ini merupakan cara pewarnaan diferensial, dimana dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi dua grup yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan di dalam air dan dilihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna yang kontras dengan medium di sekelilingnya (Sacher dan McPherson, 2004). Sebelum dilakukan pewarnaan, maka sel-sel bakteri harus terlebih dahulu difiksasi pada gelas objek. Jika kultur diambil dari medium cair, maka penyebaran dapat langsung dilakukan diatas kaca objek yang bersih menggunakan jarum loop atau jarum ose. Tetapi jika kultur diambil dari agar padat, maka sebelumnya diatas kaca objek harus diberi setetes air, kemudian kultur diambil sedikit menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, dan diratakan di atas kaca objek sehingga terbentuk lapisan tipis. Bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Sedangkan bakteri E. coli, Enterobacter aerogenes, dan Pseudomonas tergolong bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Pada proses ini yang harus dihindari adalah fiksasi panas berlebihan, yang dapat merusak integritas struktural bakteri dan morfologi sel. Alasan keberhasilan metode pewarnaan Gram adalah bahwa mikroorganisme yang tidak diwarnai, dan bakteri terwarnai dapat dibedakan berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya. Bakteri gram positif terwarnai ungu memiliki dinding sel yang tebal, dan bakteri gram negatif yang terwarnai merah memiliki dinding sel yang relatif tipis, dilapisi oleh membran luar yang mengandung lipopolisakarida. Etanol merupakan decolorizer yang lebih lambat dibandingkan dengan aseton (Sacher dan McPherson, 2004). Bakteri gram positif adalah bakteri yang memepertahankan zat warna gram A yang mengandung kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri negatif akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat warna gram D (safranin) (Brooks et al., 2001). Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ujung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu dengan lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai. Kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. Streptokokus : sel membelah diri pada satu bidang dan tetap melekat membentituk rantai, tetrakokus : sel membelah diri pada dua bidang dan membentuk kelompok yang terdiri dari empat sel. Stafilokokus : sel membelah diri pada tiga bidang dan membentuk gerombolan kokus, sarsina : membentuk kubus (Pelcszar dan Chan, 1986). Bakteri

terdapat dalam berbagai bentuk : basilus (seperti batang), kokus (bentuk bulat), spirilus (spiral), spiroketa (ulir atau heliks) dan bercabang. Karena sel-sel individual bakteri terlampau kecil, sehingga memiliki variasi dalam bentuk dan ukuran (Elrod dan Stansfield, 2006). Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Pembuatan film / apusan bakteri dilakukan sebelum proses pewarnaan gram. Beberapa langkah dalam pembuatan film ini diantaranya pembersihan gelas objek dengan kapas yang sudah diberi alkohol 70%. Pembersihan ini dimaksudkan agar gelas objek steril dan tidak ada mikroorganisme lain yang menempel pada gelas objek tersebut. Kemudian gelas objek yang sudah disterilkan tersebut dikeringkan dengan cara di angin-anginkan. Langkah selanjutnya yaitu pengambilan se suspense bakteri secara aseptis. Pengambilan dilakukan secara aseptis agar bakteri yang akan diamati tidak mengalami kontaminasi dengan mikroorganisme lain yang ada di sekitarnya. Kemudian bakteri yang telah diambil tadi dioleskan pada gelas objek dengan penyebaran setipis mungkin. Proses pewarnaan Gram memiliki beberapa tahap. Pertama, pemberian pewarna kristal violet pada bakteri yang diletakkan di atas gelas objek tadi. Pewarna kristal violet ini berguna sebagai indikator bakteri gram positif. Setelah ditetesi pewarna kristal violet, objek glas dibilas dengan air aquades, gelas objek dipegang pada posisi miring kemudian dikeringkan dengan menempelkan kertas serap yaitu kertas tissue pada bakteri tanpa mengelapnya. Kedua, pemberian Gram Iodium (lugol) yang berfungsi sebagai pembentuk kompleks ungu kristal-yodium (UK-Y), kemudian diamkan selama satu menit lalu dibilas kembali dengan air aquades dan dikeringkan seperti tadi. Ketiga, pemberian alkohol 95% untuk menghilangkan warna pada gelas objek sampai warna tidak luntur lagi ( 20 detik) lalu dibilas dan dikeringkan lagi. Keempat, pewarnaan dengan larutan safranin yang berfungsi sebagai indikator bakteri gram negatif ataupun positif selama 20 detik kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Setelah melakukan tahapan-tahapan tersebut kita akan mendapatkan

warna yang khas, warna ungu kebiruan untuk bakteri Gram positif yang menyerap pewarna kristal violet dan warna kemerahan untuk bakteri Gram negatif yang menyerap larutan safranin. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda karena tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram positif dinding selnya tersusun oleh peptidoglikan dalam jumlah besar. Sedangkan bakteri gram negatif mengandung lebih sedikit peptidoglikan namun strukturnya lebih kompleks, dimana bagian terluarnya tersusun atas lipopolisakarida (rantai karbohidrat dan lipid). Bakteri gram negatif lebih berbahaya karena lipopolisakarida bersifat racun. membran terluar bakteri gram negatif nemberikan perlindungan kepada bakteri gram negatif terhadap bertahan dari sel inang. Berdasarkan pengamatan dengan perbesaran mikroskop 100 kali yang dilakukan ketika praktikum dari sampel yang diberikan kepada praktikan adalah sampel C diperoleh bakteri dengan warna ungu kebiruan, berbentuk basil, dan bergerombol. Bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif dan merupakan bakteri Lactobacillus sp, yaitu lebih tepatnya bakteri Lactobascillus bulgaricus. Bakteri ini tidak berspora, berbentuk batang yang panjang, anaerobik fakultatif dan katalase negatif. Bakteri ini menyerupai streptokoki dalam kebutuhannya akan nutrien (Fardiaz, 1992).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Iud W 2008). Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus

Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram (Entjang I 2003). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : 1. Zat warna utama (violet kristal) 2. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama 3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama 4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali selsel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu : 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan iod. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol 96%. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas. Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir.

Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga

memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. 2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam. 3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. 4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. 7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. 8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat. 9. Peka terhadap streptomisin. 10. Toksin yang dibentuk Endotoksin.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. 2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. 3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. 4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. 6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. 7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut. 8. Tidak peka terhadap streptomisin. 9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin Berdasarkan pengamatan pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi koloni streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobacil, sampel 4 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil. Simpulan Berdasarkan pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi koloni streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobacil, sampel 4

morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil.

Daftar Pustaka Bailey and Scotts. 2007. Diagnostic Microbiology 12th edition. Mosby Elsevier : Houston. Entjang I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta : PT. Citra Aditya Bakti Iud W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang : UMM Press Jawetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC Prescott, Harley, Kleins. 2008. Microbiology 7th edition. Boston : Published by McGraw-Hill

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap kultur padat Lactobacillus acidophillus dan Streptococcus thermophilus dengan perbesaran 100x, diperoleh hasil sebagai berikut : Ilustrasi 1. Struktur Lactobacillus acidophillus Bentuk : bacillus (batang) Koloni : berkelompok Warna : biru gelap Gram : positif Bentuk : bacillus (batang) Koloni : berkelompok Warna : biru keunguan Gram : positif Sumber : Data Primer Praktikum Sumber : sitemaker.umich.edu Mikrobiologi, 2011. Berdasarkan pewarnaan Gram pada Lactobacillus acidophillus, diperoleh hasil : bentuk bakteri basil (batang), koloninya berkelompok dengan jumlah koloni 20, warna biru gelap. Warna biru gelap pada dinding sel Lactobacillus acidophillus menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif, hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan Sacher dan McPherson (2004) yaitu bakteri gram positif terwarnai ungu atau biru gelap memiliki dinding sel yang tebal. Bentuk basil pada bakteri Lactobacillus acidophillus panjang dan ramping serta ada pula yang tidak panjang dan ramping, hal ini sesuai dengan pendapat Pelczsar dan Chan (1986) yang menyatakan bahwa ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ilustrasi 2. Struktur Streptococcus thermophilus

Bentuk : coccus (bulat) Koloni : berkelompok Warna : biru gelap Gram : positif Bentuk : coccus (bulat) Koloni : berkelompok Warna : biru gelap Gram : positif Sumber : Data Primer Praktikum Sumber : picazilla.co.cc Mikrobiologi, 2011. Berdasarkan pewarnaan Gram pada Streptococcus thermophilus, diperoleh hasil : bentuk bakteri coccus (bulat), jumlah koloni TBUD dan warna dinding selnya biru gelap. Hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Pada hasil pengamatan, bakteri Streptococcus thermophilus tampak bulat dan tidak menggerombol, hal ini menunjukkan bahwa bentuknya berpasangan (diplokokus). Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Pelczsar dan Chan (1986) yaitu kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. DAFTAR PUSTAKA Brooks, G. F., Janet, S. B., dan Stephen A. M. 2001. Mikrobiologi Kedokteran Penerbit Salemba Medika, Jakarta. Campbell, N.A., J. B. Reece, dan L. G. Mitchell. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi Kelima. Erlangga, Jakarta. Darmadi. 2008. Infeksi Nosokomial. Penerbit Salemba Medika, Jakarta. Elrod, S. L. dan W. D. Stansfield. 2006. Genetika Edisi Keempat. Erlangga, Jakarta. Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Penerbit IPB, Bogor. Fardias, S. 1993. Analisis Mikrobiologi. PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta. Harmita dan Radji, M. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi 3. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Pelczsar, M. J. dan Chan ESC. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. UI-Press, Jakarta. Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara, Jakarta.

Sacher, R. A. dan R. A. McPherson. 2004. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Schlegel, H. G. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Suriawiria, U. 1993. Mikrobiologi Air. Penerbit Alumni, Bandung. Suwahyono, U. 2009. Biopestisida. Penebar Swadaya, Jakarta. www.sitemaker.umich.edu www.picazilla.co.cc Yuwono, T. 2008. Boiologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.
DAFTAR PUSTAKA Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB. Bogor Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Frazier, W. C. and D. C. Westhoff. 1978. Food Microbiology. 3th edition. Tata McGraw-Hill New Delhi. Halferich,W. dan D.C. Westhoff. 1980. All About Yogurt. Prentice Hall. Inc New York Pelczar, Michael J. Dan E. C. S. Chan. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press). Jakarta. Sumanti, Debby M. dkk. 2009. Diktat Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Jurusan Teknologi Industri Pangan Fakultas Teknologi Industri Pertanian Universitas Pasjadjaran Robert Wayne Hutkins. 2006. Microbiology and Technology of Fermented Foods. Wiley-Blackwell. Anonima. 2011. Gambar Lactobascillus bulgaricus. http://www.novinite.com/media/images/2004-04/33678.jpg diakses tanggal 4 Maret 2011 Anonimb. 2011. Gambar Lactobacillus acidophilus. http://www.museeafrappier. qc.ca/images/site/large/lactobacillus-acidophilus02-milos-kalab.jpg diakses tanggal 4 Maret 2011 Anonimc. 2011. Gambar Streptococcus thermophilus. http://www.buyprobiotics.com/Miva_Graphics/Micro6.jpg diakses tanggal 4 Maret 2011 Anonimd. 2011. Gambar Bifidobacterium bifidum. http://www.sciencephoto.com/images/download_wm_image.html/B2201561Bifidobacterium_bifidum-SPL.jpg?id=662201561 diakses tanggal 4 Maret 2011 Anonime. 2011. Gambar Saccharomyces cereviceae.

http://www.deanza.edu/faculty/mccauley/6a_site_images/fungiimages/ saccharomyces-400.jpg diakses pada 5 Maret 2011 Jenis Lactobacillus dapat dibedakan atas dua kelompok, yaitu: 1. Bersifat homofermentatif Bakteri homofermentatif memecah gula menjadi asam laktat dan dapat tumbuh pada suhu 370C atau lebih. Spesies yang tergolong homofermentatif misalnya: a. Lactobacillus bulgaricus b. Lactobacillus lactis c. Lactobacillus acidophilus d. Lactobacillus thermophilus e. Lactobacillus delbrueckii 2. Bersifat heterofermentatif Bakteri heterofermentatif memecah gula menjadi asam laktat dan produk-produk lain seperti alkohol, asetat dan karbondioksida. Spesies yang tergolong heterofermentatif misalnya Lactobacillus fermentatum dan Lactobacillus brevis. (Fardiaz, 1992). Bakteri yang diamati pada praktikum ini selain bakteri Lactobascillus bulgaricus adalah bakteri Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus dan Bifidobacterium bifidum. Bakteri Lactobacillus acidophilus merupakan bakteri gram positif karena setelah diberi pewarnaan gram dan diamati di bawah mikroskop bakteri ini berwarna ungu kebiruan, berbentuk basil atau batang, bersifat non motil, dan nonspora yang memproduksi asam laktat sebagai produk utama dari metabolisme fermentasi dan menggunakan laktosa sebagai sumber karbon utama dalam memproduksi energi. Lactobacillus acidophilus dapat tumbuh baik dengan oksigen ataupun tanpa oksigen, dan bakteri ini dapat hidup pada lingkungan yang sangat asam sekalipun, seperti pada pH 4-5 atau dibawahnya dan bakteri ini merupakan bakteri homofermentatif yaitu bakteri yang memproduksi asam laktat sebagai satusatunya produk akhir. Gambar 3. Bakteri Lactobacillus acidophilus (sampel A). Perbesaran 160/0,17 Sedangkan gambar bakteri Lactobacillus acidophilus berdasarkan literatur adalah sebagi berikut: Gambar 4. Bakteri Lactobacillus acidophilus (musee-afrappier,2011) Antara gambar yang diperoleh berdasarkan hasil di bawah mikroskop tidak terjadi perbedaan. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri yang diamati benar-benar merupakan bakteri Lactobacillus acidophilus. Nova Nurfauziawati 240210100003 Kelompok 1A

Sampel lain yang digunakan dalam praktikum ini adalah sampel D yang merupakan bakteri Streptococcus thermophilus. Bakteri jenis ini memiliki bentuk kokus atau bulat, bergerombol dan merupakan bakteri gram positif. Namun, pada praktikum kali ini, praktikan menemukan bahwa bakteri ini merupakan bakteri gram negatif. Kesalahan ini mungkin disebabkan karena perlakuan fiksasi yang terlalu lama ataupun karena agar yang tidak sengaja terambil pada saat pengambilan sampel. Selain itu, juga bisa disebabkan karena terkotaminasi. Kemungkinan lain yang dapat menyebabkan kesalahan ini adalah kotornya lensa pada mikroskop yang digunakan untuk mengamati bakteri tersebut. Berikut ini merupakan bakteri Streptococcus thermophilus Gambar 5. Streptococcus thermophilus (sampel D) Perbesaran 16 x 40 Sedangkan gambar berdasarkan literatur adalah sebagai berikut: Gambar 6. Streptococcus thermophilus (buyprobiotics, 2011) Streptococcus memiliki karakteristik berbentuk bulat, hidup berpasangan dengan rantai pendek atau panjang yang tergantung pada spesies dan kondisi pertumbuhannya, dan semuanya bersifat homofermentatif (Frazier dan Westhoff, 1978, Pelczar dan Chan, 1988). Streptococcus memiliki diameter yang kurang dari 2m, membutuhkan kondisi nutrisi yang kompleks dengan suhu pertumbuhan Nova Nurfauziawati 240210100003 Kelompok 1A optimum sekitar 370C (Pelczar dan Chan, 1988). Beberapa spesies bersifat proteolitik dan biasanya bersifat lipolitik (Fardiaz, 1989). Streptococcus thermophilus merupakan spesies yang tergolong grup viridan, penting dalam pembuatan keju (Frazier dan Westhoff, 1978), dapat tumbuh pada suhu 450C dan masih tahan dengan perlakuan suhu 600C selama 30 menit (Fardiaz, 1989). Secara morfologis, Streptococcus thermophilus berbentuk bulat, sering hidup dalam bentuk rantai, bersifat termofilik dengan pH optimum untuk pertumbuhannya sekitar 6,6 6,8 (Helferich dan Westhoff, 1980). Sesuai dengan namanya, bakteri Streptococcus thermophilus bersifat termofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh dalam suhu yang relatif tinggi dengan suhu minimum 250C, suhu optimum 44-550C dan maksimum 55650C. Sampel terakhir yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu sampel B dengan nama bakteri Bifidobacterium bifidum. Beberapa karakteristik dari bakteri Bifidobacterium ini adalah gram-positif, anaerobik, non-motil (tidak bergerak), tidak membentuk spora, berbentuk batang, dan memiliki persen G+C (guanosin-sitosin) yang tinggi (55-67%). Sel umumnya terlihat berpasangan membentuk huruf V atau Y.[ Suhu optimal untuk pertumbuhan

Bifidobacterium adalah 37-41 C dan pH optimum antara 6,5-7. Dari 30 spesies Bifidobacterium yang ditemukan, beberapa di antaranya digunakan sebagai probiotik, yaitu Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, dan Bifidobacterium thermophilum. Bakteri ini telah digunakan secara komersial sebagai probiotik dalam pembuatan yogurt dan produk olah susu lainnya. Pada praktikum kali ini, setelah pengamatan di bawah mikroskop, praktikan menemukan bahwa bakteri Bifidobacterium bifidum ini berbentuk coccus, padahal seharusnya bakteri jenis ini berbentuk basil. Kesalahan ini mungkin disebabkan karena perlakuan fiksasi yang terlalu lama ataupun karena agar yang tidak sengaja terambil pada saat pengambilan sampel. Selain itu, juga bisa disebabkan karena terkotaminasi. Kemungkinan lain Nova Nurfauziawati 240210100003 Kelompok 1A yang dapat menyebabkan kesalahan ini adalah kotornya lensa pada mikroskop yang digunakan untuk mengamati bakteri tersebut. Berikut ini merupakan bakteri Bifidobacterium bifidum Gambar 7. Bifidobacterium bifidum (sampel B) Perbesaran 100 kali Berdasarkan hasil pengamatan Bifidobacterium bifidum berbentuk coccus, padahal seharusnya berbentuk basil sesuai dengan gambar berdasarkan literatur sebagai berikut: Gambar 8. Bifidobacterium bifidum (sciencephoto, 2011) Bifidobacterium bifidum adalah organisme probiotik sangat penting yang ditemukan dalam jumlah besar di usus dan mukosa vagina. Bifidobacterium bifidum mencegah perkembangbiakan E. coli, Salmonella dan Clostridium. Bakteri ini juga memproduksi asam laktat dan asam asetat yang menurunkan pH usus dan mencegah pertumbuhan bakteri jahat. Penelitian lain pada Bifidobacterium menunjukkan bahwa organisme ini juga merangsang penyerapan mineral seperti besi, kalsium, magnesium, dan seng. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain tidak berwarna, bakteri itu juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itulah pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Adapun macam-macam pewarnaan, antara lain : 1. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini

dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin. 2. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. 3. Pewarnaan Kapsul Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel. 4. Pewarnaan Spora Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis. Teknik- teknik pewarnaan secara umum, antara lain : A. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai, gerombol, berpasangan, dan tetrad). B. Pewarnaan diferensial Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan pewarna inti. V. CARA KERJA A. Pewarnaan Sederhana 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide; 2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen; 3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass; 4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen; 5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali; 6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering; 7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri; 8. Mendiamkannya selama 1 menit; 9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades; 10. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering; 11. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;

12. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati, 13. Mengamati slide tersebut. B. Pewarnaan Gram 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide; 2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen; 3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass; 4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen; 5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali; 6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering; 7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri; 8. Mendiamkannya selama 1 menit; 9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades; 10. Meneteskan iodine hingga menutupi permukaan bakteri kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 1-2 menit; 11. Membilas biakan tadi dengan air akuades; 12. Meneteskan alkohol 95% ke atas bakteri kemudian mendiamkannya selama 30 detik; 13. Membilasnya dengan air akuades; 14. Meneteskan safranin ke atas bakteri dan mendiamkannya selam kurang lebih 1 menit, kemudian membilasnya dngan air akuades; 15. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering; 16. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass; 17. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati, 18. Mengamati slide tersebut. C. Pewarnaan Spora 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide; 2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen; 3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass; 4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen; 5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali; 6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering; 7. Setelah tampak keputih-putihan pada objek glass tersebut, kemudian merendam dengan malachit green selama 10 menit;

8. Melewatkan objek glass tersebut di atas api bunsen dengan tidak terlalu sering, dan jika pewrana sudah kering, perlu ditambhkan lagi pewarna tersebut (diusahakan selama 10 menit tersebut malachit green tidak kering); 9. Setelah 10 menit, mencuci objek glass dengan akuades hingga warna hilang; 10. Mengeringkan sisa pencucian tado dengan tisue kering; 11. Merendam dengan safranin selama 1 menit; 12. Mencuci kembali dengan akuades; 13. Mengeringkan slide dengan dilewatkan pada api bunsen; 14. Menutup dengan cover glass; 15. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati; 16. Mengamati slide tersebut. VI. HASIL PENGAMATAN No Bakteri Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan spora 1 Bacillus subtilis Strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), susunan bekterinya berantai. Termasuk gram positif. Memiliki endospora. 2 Staphylococcus aureus Berbentuk coccus, susunan bakterinya bergerombol seperti buah anggur. Termasuk gram positif. 3 Pseudomonas putida Berbentuk batang pendek (cocoid), susunan bakterinya tunggal. Termasuk gram negatif. VII. PEMBAHASAN a. Pewarnaan Sederhana 1. Pewarnaan Sederhana pada Bacillus subtilis Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus subtilis zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus subtilis yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai. 2. Pewarnaan Sederhana pada Pseudomonas putida Pada pengecatan mikroba jenis Pseudomonas putida dilakukan pengecatan dengan menggunakan zat warna basa kristal violet. Pertama jarum inokulasi disterilkan lalu kemudian mulut tabung reaksi disterilkan juga di api bunsen, kemudian mikroba yang ada di tabung reaksi (media agar miring) diambil dan diletakkan di objek glass,

sebelumnya objek glass sudah diberi air sedikit. Kemudian setelah mikroba dan air dicampur, dilakukan metode smear yaitu meratakan mikroba kira-kira membentuk sebuah bentuk koin. Kemudian dilakukan fiksasi yaitu dengan melewatkan smear secara cepat di api bunsen, lalu dikering-anginkan. Setelah melakukan metode smear, selanjutnya adalah metode pengecatan. Objek glass yang sudah di titrasi diberi pewarna kristal violet (selama 60 detik). Kemudian diberi air aquades untuk membersihkan kelebihan warna. Sisa-sisa air yang ada di objek glass dibersihkan dengan tissue. Terakhir objek glass ditutup dengan cover glass, dan diletakkan di mikroskop cahaya untuk diamati dengan perbesaran 1000 X dengan catatan menggunakan minyak emersi setelah menemukan titik fokus perbesaran 40 X. 3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus Kaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus aureus, kemudian dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak lapisan putih yang tipis, semitransparan, dan rata yang menunjukkan adanya bakteri. Setelah smear difiksasi, smear kemudian diberi pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam pemberian metilen blue ini, diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear. Pewarnaan dengan menggunakan metilen biru dibutuhkan waktu 2-60 detik, setelah itu dicuci dengan aquades. Dari sini akan nampak lapisan yang sebelumnya berwarna putih tipis dan semitransparan, akan berubah warna menjadi biru transparan. Selanjutnya adalah milangkan sisa aquades dengan menggunakan kertas tissue. Setelah itu dilihat dalam mikroskop dengan perbesaran 1000 X. dalam mikroskop akan nampak bakteri Stapylococcus aereus berwarna biru matang dan bentuk bulat berantai. B. Pewarnaan Gram 1. Pewarnaan gram pada Bacillus subtilis Pada pewarnaan ini digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama (mordant), alcohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa pada Bacillus subtilis memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang. Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol. 2. Pewarnaan Gram pada Pseudomonas putida Pada pengamatan genus Pseudomonas dengan menggunakan pewarnaan gram, kami menggunakan bakteri Pseudomonas putida sebagai contoh yang mewakili. Sebelum mewarnai perlu difiksasi di atas api bunsen, pertama kali, koloni bakteri disuspensikan

secara tipis di atas akuades. Smear yang tipis memberikan hasil pada gelas objek dan dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna. Kompleks UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri Pseudomonas yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan dapat masuk apabila pewarna utamanya telah keluar dari sel bakteri. Bakteri pseudomonas dapat terwarnai merah. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki karateristik mikroskopik sebagai berikut yang diamati di bawah mikroskop cahaya yaitu : Gram-negatif; Berbentuk kokoid (batang pendek); Tidak membentuk spora. 3. Pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri negatif dan bakteri positif. Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Staphylococcus aureus yang termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang berwarna biru terang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 1,0 m. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37 dengan waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri dari fagositosis host, selain itu bakteri tersebut merupakan bakteri patogen. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut: 1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol

yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. 2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. C. Pewarnaan Spora 1. Pewarnaan Spora pada Bacillus subtilis Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Bacillus subtilis memiliki endospora, endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. VIII. KESIMPULAN Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa : 1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan pengecatan gram, pengecatan sederhana, dan pengecatan spora. 2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna. 3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu. 4. Pengecatan spora dilakukan dengan memberi warna pada endospora suatu bakteri. Zat pewarna yang digunakan pertama adalah malachit green. Pengecatan spora digunakan untuk mengetahui spora dengan sel vegatatifnya. 5. Pada preparasi smear, ketebalan smear sangat penting dalam pengamatan di mikroskop. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis. 6.Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-anginkan dua-tiga kali pada api bunsen.

7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna merah pada pewarnaan safranin. IX. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:09. Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasibakteri.html) diakses pada 29 Oktober 2010 13:28. Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29. Nurodin, Ade., 2009. http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparatbakteri-pewarnaan.html diakses pada 29 Oktober 2010 13:17. Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Stanier Roger, Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia Mikroba 1. Jakarta: Bharata Karya Aksara.