PENGECATAN GRAM

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi,

struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup

hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri

tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati

bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk

diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan

sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal

tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu

mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu

cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara

komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang

disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik

pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya

muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Adapun yang melatar belakangi dilakukan praktikum pengecetan

bakteri ini yaitu untuk mengetahui bentuk-bentuk dari bakteri dan untuk

mengetahui jenis bakteri apakah termaksud dalam bakteri gram positif

atau negatife.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

B. Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah pada percobaan ini yaitu :

1. Apa perbedaan dari pengecatan sederhana, pengecatan Gram, dan

pengecatan negatif ?

2. Bagaimana metode dan langkah-langkah dalam melakukan

pengecatan sederhana, pengecatan Gram, dan pengecatan negatif ?

3. Jenis pewarna apa saja yang digunakan dalam pengecatan

sederhana, pengecatan Gram, dan pengecatan negatif ?

C. Maksud Praktikum

Adapun maksud dari praktikum ini adalah mengetahui dan

memahami cara-cara pengecatan suatu bakteri atau mikroorganisme.

D. Tujuan Praktikum

Adapun tujuan percobaan adalah untuk mengamati morfologi

bakteri dengan mengggunakan metode pengecatan sederhana,

pengecatan negatif dan pengecatan Gram (positif dan negatif).

E. Manfaat Praktikum

Adapun manfaat dari praktikum ini adalah praktikan dapat

mengetahui morfologi bakteri dengan menggunakan metode pengecatan

sederhana dan pengecatan negatif, dan pengecatan Gram.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

A. Teori Umum

Pewarnaan mikroorganisme pada dasarnya adalah prosedur

mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat

menonjolkan struktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati.

Sebelum mikroorganisme dapat diwarnai, mikroorganisme tersebut harus

terlebih dahulu difiksasi agar terikat (menempel) pada kaca objek. Tanpa

adanya fiksasi, maka pemberian zat warna pada MO yang dilanjutkan

dengan prosedur pencucian zat warna dengan air mengalir dapat

menyebabkan MO ikut tercuci (Pratiwi, 2008).

Sebelum bakteri atau mikroorganisme dilakukan pengecatan,

harus dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Cara-cara pengecatan pada

umumnya yang paling banyak digunakan adalah cara fisik (dengan

pemanasan atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan menggunakan

reagensia kimia (Djide, 2015).

Adapun fungsi dari fiksasi (Djide, 2015) :

1. Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel.

2. Mempertinggi sifat gugus-gugus reaktif.

3. Merubah afinitas cat

Fungsi pengecatan terutama untuk memberi warna pada sel atau

bagian-bagiannya, sehingga menambah kontras dan tampak lebih jelas.

Selain dari pada itu pengecatan dapat juga menunjukkan bagian-bagian

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

struktur sel, menunjukkan distribusi dan susunan kimia bagian-bagian

(konstituen) sel, membedakan mikroorganisme satu dengan yang lain,

menentukan pH dan potensial oksidasi-reduksi ekstra seluler dan

intraseluler (Djide, 2015).

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan

sederhana, pewarnaan diferensial, dan pewarnaan khusus. Pada

pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam pewarna dan

bertujuan mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler

dan struktur dasarnya dapat terlihat. Biasanya ditambahkan suatu bahan

kimia untuk mengintensifkan warna dengan cara meningkatkan afinitas

pewarna pada spesimen biologi. Contoh pewarna sederhana adalah

carbol fusin dan safranin (Pratiwi, 2008).

Salah satu pewarnaan yang sering digunakan untuk

mengidentifikasi bakteri adalah pewarnaan gram. Berdasarkan pewarnaan

gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan , tergantung dari reaksi

dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal violet. Bakteri yang tetap

berwarna ungu dengan pewarnaan oleh kristal violet disebut bakteri gram

positif, misalnya Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus,

sedangkan bakteri yang warna ungunya hilang jika dibilas dengan alkohol,

tetapi berwarna merah muda karena menahan warna safranin bakteri

gram negatif misalnya Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (James,

2008).

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

Pewarnaan gram dapat digunakan untuk determinasi bakteri, yaitu

dengan melihat hasil akhir pewarnaan bakteri. Pada akhir pewarnaan,

gram positif berwarna ungu (violet) dan bakteri gram negatif berwarna

merah. Perbedaan tersebut terjadi karena adanya perbedaan kompisisi

dinding selnya, dimana pada bakteri gram negatif lebih rumit dari pada

gram positif (Pratiwi, 2008).

Bakteri yang sudah diberi warna dapat dilihat bentuknya dengan

mikroskop cahaya. Bentuk bakteri juga berguna untuk mengidentifikasi

bakteri misalnya bentuk sferis (kokus), bentuk batang (basilus), bentuk

koma (vibrio) (James, 2008).

Pewarnaan negatif tidak hanya merupakan cara khusus untuk

memvisualisasikan protein saja, namun dapat pula digunakan untuk

lipoprotein, kompleks nukleoprotein, isolasi organela, misalnya

mitokondria atau fragmen-fragmennya. Dengan cara yang cepat dapat

digunakan untuk memeriksa kualitas fraksi selama isolasi dari bagian sel

tertentu seperti halnya sel yang utuh, misalnya sel bakteri (Hariano, 2013).

Spesimen yang sudah terwarnai dapat diperiksa secara mikroskopi

elektron dalam waktu beberapa menit setelah dilakukan pewarnaan.

Biasanya spesimen mempunyai sifat relatif stabil dan dapat pula disimpan

dalam desikator untuk beberapa minggu (Hariano, 2013).

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

B. Uraian Bahan

1. Alkohol (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Aethanolum

Nama lain : Alkohol, etanol

BM / RM : 46,07 / C2H6O

Pemerian : Cairan mudah menguap, tak berwarna, bau khas,

mendidih pada suhu 78oC.

Kelarutan : Bercampur dengan air dan praktis bercampur

dengan semua pelarut

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai antiseptik.

2. Air Suling (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Aqua Destillata

Sinonim : Air suling, aquadest

BM/RM : 18,02 / H2O

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau,

tidak berasa.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

Kegunaan : Sebagai pelarut.

3. Metilen Biru (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Methylthionini chloridum

Sinonim : Metilen biru, Metiltionina klorida

RM/BM : C16H18CIN3S.2H2O/372,90

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

Pemerian : Serbuk hablur mengkilap seperti logam atau suram

Kehijauan tua atau serbuk warna coklat; hampir

tidak berbau. Higroskopik.

Kelarutan : Larut dalam 40 bagian air, dalam 110 bagian etanol

(95%)P dan dalam 450 bagian kloroform P.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai pewarna dalam mengidentifikasi mikroba.

4. Kristal violet (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Kristal violet

Sinonim : Kristal violet

Pemerian : Hablur berwarna hijau tua

Kelarutan : Sukar larut dalam air, agak sukar larut dalam

Etanol (95%) P dan dalam asam asetat glasial P,

larutannya warna lembayung tua.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai cat utama atau Gram A dalam pengecatan

Gram.

5. Nigrosin (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Nirgosin

Nama lain : Nigrosin

Pemerian : Serbuk halus berwarna biru keuangan

Kelarutan : Tidak larut dalam air

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

Kegunaan : Sebagai pewarna (larutan Mordan).

6. Safranin (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Safranin

Pemerian : Serbuk halus berwarna biru keunguan.

Kelarutan : Tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan : Sebagai komposisi cat D.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

BAB III

METODE KERJA

A. Alat

Adapun alat – alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah

Botol semprot, Korek api, Mikroskop, Objek dan deck glass, Ose bulat,

Pipet tetes, Spiritus,

B. Bahan

Adapun bahan- bahan yang digunakan pada praktikum kali ini

Alkohol asam, Aquadest, Kristal violet, Larutan Mordan, Larutan Nigrosin,

Larutan Safranin, Metilen biru, Tissue.

C. Cara Kerja

A. Pengecatan Negatif

Dibersihkan gelas obyek dengan alkohol sehingga bebas lemak,

lalu difiksasi. Setelah dingin, diambil suspense biakan murni bakteri uji

dengan ose secara aseptis dan diletakkan diatas gelas obyek.

Kemudian diambil tinta cina atau nigrosin dengan ose sedikit dan

dicampurkan dengan suspense yang telah terletak di atas obyek

gelas. Dicampur sampai homogeny dan terlihat sangat tipis.

Selanjutnya preparat dibiarkan kering di udara. Diamati dengan

mikroskop dengan pembesaran kuat. Diulangi poin 1 s/d untuk biakan

murni uji lainnya.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

B. Pengecatan Sederhana

Dibersihkan gelas obyek dengan alkohol 70% sampai bebas

lemak, kemudian dipanggang di atas api lampu spiritus. Diambil

secara aseptis 1 ose suspense bakteri dan diratakan di atas gelas

obyek. Dibiarkan preparat tersebut kering di udara. Setelah kering

preparat difiksasi dengan cara dipanaskan di atas lampu spiritus.

Setelah dingin, noda pada gelas obyek ditetesi dengan metilen biru 1

atau 2 tetes dan dibiarkan 1 atau 2 menit. Dicuci dengan air mengalir

sampai sisa-sisa cat tercuci seluruhnya. Dikeringkan di udara dan

diamati di bawah mikroskop

C. Pengecatan Gram

Disiapkan preparat olesan bakteri. Dikeringkan di udara, setelah

kering difiksasi di atas lampu spiritus. Setelah dingin, diteteskan cat

GRAM A sebanayak 2-3 tetes, dibiarkan 1 menit. Dicuci dengan air

mengalir, dikeringkan di udara atau kertas isap. Diteteskan larutan

GRAM B, di biarkan selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir dan

dikeringkan. Ditetskan larutan GRAM C selama 30 detik. Dicuci

dengan air mengalr dan dikeringkan. Diteteskan larutan GRAM C

selama 2 menit. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Diamati

dengan mikroskop dengan perbesaran kuat. Digambar hasil-hasil

pengecatan tersebut.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

BAB IV

KAJIAN PRAKTIKUM

A. Data Pengambilan

1. Gambar Hasil Pengamatan

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

2. Tabel Pengamatan

a) Pengecatan Sederhana

No Bakteri Bentuk Nama Cat Pengamatan

1 xx Batang Metilen blue Bakteri

(bacillus) berwarna biru

b) Pengecatan Negatif

No Bakteri Bentuk Nama Cat Pengamatan

1 xx Batang Nigrosin Bakteri berwarna

(Bacillus) putih dengan latar
ungu

c) Pengecatan Gram

No Bakteri Bentuk Nama cat Pengamatan

Bakterinya
1 xx Batang A. Kristal violet
berwarna biru
(Bacillus) B. Larutan
(gram negatif)
Mordant
C. Alkohol asam
D. Safranin

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

B. Pembahasan

Setiap mikroorganisme memiliki morfologi, struktur serta sifat-sifat

yang khas. Bakteri yang merupakan mikroorganisme juga memiliki

morfologi, struktur yang khas, namun bakteri memiliki warna yang

transparan atau tidak berwarna dan kontras dengan air sehingga

menyulitkan untuk melihat strukur dan morfologi bakteri.

Salah satu cara untuk mengamati sel bakteri sehingga mudah

untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan

sehingga mudah untuk mengetahui struktur dan morfologi bakteri.

Pada praktikum ini, dilakukan tiga metode pengecatan yaitu

pengecatan sederhana, pengecatan negatif dan pengecatan gram. Pada

pengecatan sederhana digunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai

mikroba, dimana cat tersebut memberikan warna pada sel bakteri

sehingga sel bakteri akan berwarna sesuai dengan cat yang digunakan

dan pada pengecatan ini dilakuakn fiksasi yang bertujuan untuk

melekatkan sel pada gelas obyek, membunuh mikroba karena sel dalam

keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada sel dalam keadaan hidup.

Untuk pengecatan sederhana dilakukan dengan cara disiapkan alat

dan bahan yang akan digunakan, kemudian diambil satu ose suspensi

bakteri secara aseptis. Satu ose suspensi bakteri tersebut diratakan di

atas gelas objek, lalu difiksasi. Selanjutnya ditetesi dengan Methylen Blue

sebanyak 1 – 2 tetes dimana metilen blue sebagai zat atau cat yang akan

memberikan warna pada sel bakteri yang akan Kemudian didiamkan

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

selama 15 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir dan sisa air diserap

dengan tissu. Terakhir diamati dibawah mikroskop. Adapun hasil

pengamatan yang diperoleh yaitu didapatkan bentuk morfologinya

berbentuk bacillus (batang).

Pada pengecatan negatif digunakan cat asam seperti eosin atau

nigrosin, cat yang digunakan memberikan warna pada latar belakang

sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna.

Untuk pengecatan negatif disiapkan alat dan bahan yang akan

digunakan. Kemudian diteteskan dengan 1 tetes nigrosin dipinggir objek

gelas, lalu diambil satu ose biakan murni dan dicampur dengan Nigrosin

yang sebelumnya telah diletakkan dipinggir objek gelas. Nigrosin yang

bermuatan negatif dapat mewarnai permukaan sel bakteri membentuk

kompleks warna sehingga struktur sel akan terlihat bening atau

transparan. Selanjutnya, diambil objek glass yang lain, lalu ditempatkan

pada nigrosin pada sudut 30o dan setelah sudah menyebar ke bagian

objek tersebut, lalu dengan cepat digeser kekiri sehingga terbentuk olesan

tipis di preparat. Terakhir diamati dibawah mikroskop. Adapun hasil

pengamatan yang diperoleh yaitu didapatkan bentuk morfologinya

berbentuk bacillus (batang).

Pada pengecatan gram, dilakukan untuk membedakan antara

bakteri gram negatif dan bakteri gram positif dengan menggunkan empat

cat pewarna, cat pertama sebagai cat utama, cat kedua sebagai

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

pengintensifan cat utama, cat ketiga sebagai pencuci dan cat keempat

sebagai cat penutup.

Untuk pengecatan Gram, diambil satu ose biakan murni dan

dioleskan pada objek gelas lalu difiksasi. Kemudian ditambahkan dengan

Kristal Violet (Gram A) sebagai cat utama sebanyak 1 tetes selama 30

detik lalu dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya, ditambahkan mordant

(Gram B) sebagai cat pengintensifan cat utama sebanyak 1 tetes selama

30 detik, untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri

menjadi lebih kuat, kemudian dicuci dengan air mengalir dan sisa airnya

diserap dengan tissu. Selanjutnya, ditambahkan dengan Alkohol (Gram C)

sebagai larutan pembersih atau peluntur cat sebanyak 1 tetes selama 1

menit lalu dicuci dengan ar mengalir dan sisa airnya diserap dengan

tissue. Selanjutnya ditambahkan dengan Safranin (Gram D), yang

digunakan sebagai cat penutup, sebanyak 1 tetes selama 1 menit lalu

dicuci dengan air mengalir dan sisa airnya diserap dengan tissue. Terakhir

ditutup dengan dek gelas lalu diamati di bawah mikroskop. Adapun hasil

pengamatan yang diperoleh yaitu didapatkan bentuk morfologinya

berbentuk bacillus (batang) dan warna yang diperoleh berwarna biru

artinya dia masuk kedalam golongan bakteri gram negatif.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Adapun kesimpulan yang didapatkan pada praktikum kali ini yaitu

diperoleh hasil pengamatan yaitu :

a. Pada pengecatan sedarhana diperoleh hasil bahwa dengan

menggunakan cat Metilen blue diamati bakteri xx memiliki bentuk

morfologi batang (Bacilus) dengan warna biru.

b. Pada pengecatan negatif diperoleh hasil bahwa dengan

menggunakan cat Nigrosin diamati bakteri xx memiliki bentuk

morfologi batang (Bacilus) dengan warna putih dan warna latar

belakang adalah ungu.

c. Pada pengecatan Gram memiliki hasil bahwa bakteri xx berwarna biru

menandakan bakteri tersebut masuk golongan Gram negatif.

B. Saran

Diharapkan kepada praktikan agar lebih teliti dalam hal mendapatkan

data pengamatan dan diharapkan praktikan mengetahui cara kerja dalam

praktikum agar berjalan dengan lancar.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

DAFTAR PUSTAKA

Ditjen POM, 1979, Farmakope Indonesia Edisi III, Depkes RI, Jakarta.

Djide, M Natsir, 2015, Mikrobiologi Dasar, Universitas Hasnuddin:

Makassar.

Hariano, Bambang, 2013, Mikroskopi elektron, Kanisius: Yogyakarta.

Harti, S. 2015, Dasar-Dasar Mikrobiologi Kesehatan, Medical Book,

Jakarta

James, Joyce., Baber, Colin., Swain., Helen. 2008. Prinsip-prinsip Sains

untuk Keperawatan. Erlangga: Jakarta.

Pratiwi. T. 2008, Mkrobiologi Farmasi, Erlangga: Jakarta.

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

LAMPIRAN

SKEMA KERJA

1. Pengecatan sederhana

Ambil 1 ose suspensi biakan secara aseptis

Ratakan diatas gelas objek

Fiksasi

Tetesi metilen blue 1 – 2 tetes biarkan 1 – 2 menit

Cuci dengan air mengalir

( sisanya dicuci dengan tissue)

Amati di bawah mikroskop

( perbesaran 40 x)

2. Pengecatan Negatif

Diletakkan setetes nigrosin pada ujung glass objek

Dimasukkan inokulum bakteri dari ose kedalam nigrosin

Diambil objek glass lalu letakkan disebelah luar nigrosin dengan posisi

miring (30o)

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002
 PENGECATAN GRAM

Diamati di bawah mikroskop

3. Pengecatan Gram

Gores 1 ose suspensi bakteri pada objek glass

Tambah 1 tetes Gram A (Kristal Violet)

Biarkan 1 menit

Cuci dengan air mengalir, sisanya hisap dengan tissue

Tetesi Gram B (Larutan Mordant)

Biarkan 1 menit

Cuci dan keringkan

Tetesi Gram C (Alkohol asam)

Didiamkan 30 detik

Cuci dan keringkan

Tetesi Gram D (safranin)

Diamkan 30 detik

Cuci dan Keringkan

Amati dibawah mikroskop

NURUL AENUNG MUHAMMAD WAIS

15020160002