ACARA IX

PEWARNAAN BAKTERI
A. TUJUAN
Tujuan percobaan ini adalah :
1. Mempelajari dasar-dasar kimia pewarnaan Gram dan pewarnaan spora
2. Mempelajari prosedur untuk membedakan bakteri menjadi golongan Gram positif dan Garam
negatif
3. Mempelajari prosedur membedakan bakteri antara pembentuk spora dan sel vegetatif
Hari/tanggal
Tempat

: Senin, 2 Mei 2011

: Laboratorium Biologi FKIP
Universitas Mataram

B. LANDASAN TEORI
Bakteri memiliki beberapa bentuk seperti basil, kokus dan spirilum. Bakteri berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi bebrapa macam yaitu basil tunggal, diplobasil dan
tripobasil. Demikian juga bakteri berbentuk coccus terbagi atas monococus, diplococus samapi
staphylococcus. Untuk mengidentifikasi jenis-jenis bakteri tersebut maka dilakukan suatu
metode yang disebut pewarnaan gram (Arif, 2011).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk mebedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negative berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri. Bakteri Gram negative adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan Gram, sedangkan bakteri Gram
postif akan mempertahan kan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol. Pada uji
pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal ditambahkan setelah metal ungu yang menyebabkan
semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berfungsi
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya
(Junaidi, 2010).
Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas
terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal.
Supaya bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipalajari maka tingkat sel kontras itu dapat
ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud dengan pewarnaan disini adalah perlakuan
dengan zat warna yang mengikat secara selektif baik seluruh sel maupun komponen sel tertentu,
sehingga dapat menghasilkan penyerapan cahaya yang jauh lebih besar. Kebanyakan perlakuan
pewarnaan dapat membunuh sel oleh karena itu sebelum sel itu difiksasi dengan perlakuan
memakai zat kimia yang bertujuan untuk mengurangi perubahan struktur sel yang telah mati
Zat untuk fiksasi yang biasa digunakan adalah asam osmat dan aldehid, erutam glutar aldehid.
Salah satu bakteri yang sering diamati dengan menggunakan pewarnaan adalah bakteri gram.
Warna yang terlihat di mikroskop adalah menunjukkan jenis bakteri gram tersebut positif atau
negative (Agushna, 2011).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat terjadi

karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel
bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan
ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif.
Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain.
Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh
dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya
metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain (Anonim, 2011).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme
tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui
bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin (Caray, 2008).
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan
diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium
disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel.
Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan
sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas
beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan
dan pewarnaan untuk menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Arif, 2011).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri
di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu
padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri
dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada
object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan
memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion
yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam
keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan
positif ataupun negative. Adapun jenis jenis zat untuk pewarnaan gram adalah: (Suriawiria,
1985)
1. Gram A (violet) :
a. Kristal violet
b. Alkohol
c. Ammonium oksalat
d. Aquades
2. Gram B (cokelat)
a. Iodium
b. Kalium iodide
c. Aquades
3. Gram C
a. Aseton
b. Alcohol
4. Gram D (merah)
a. Safranin

b. Alcohol
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua
kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut
warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua
disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan
tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan
tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak
tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin
berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup.
Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat
pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan,
2008):
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CViodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan
overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan
sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan
CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari
24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV),
khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel,
sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa
species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista
amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase
dimana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar
yang tidak menguntungkan. Sepanjang pengetahuan yang kita miliki sekarang, hanya golongan
basillah yang dapat membentuk spora, akan tetapi tidak semua basil mampu berbuat demikian.
Beberapa spesies Bacillus yang aerob dan beberapa spesies Clostridium yang anaerob dapat
membentuk spora. Spora ini lazim disebut endospora, dikarenakan spora itu dibentuk di dalam
sel (Musyaraffalah, 2010).
Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel
vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah
mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat
refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan
inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan
endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008):
Tabel B.1. bentuk dan jenis Bakteri
No.
Bentuk
Contoh Jenis
1.
Coccus (sphere)
Neisseria, Veillonella, Enterococcus

2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

Coccobacilli
Bacilli (rod), rounded ends
Vibrio (curved)
Bacilli (Rod), blunt end
Helical (spirillum)
Diplococcus
Streptococcus
Streptobacillus
Staphylococcus
Tetrad (Gaffkya)
Sarcina (cuboid packets)

Moraxella, Acinetobacter
Escherichia, Lactobacilus, clostridium
Vibrio, Bdellovibrio, Anycylobacter
Bacillus
Spirochaeta, Spirillum, Campylobacter
Neisseria, Moraxella
Streptococcus
Bacillus, Mycobacterium
Staphylococcus
Deinococci, Pediococcus, Micrococcus
Sarcina

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali
diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode
pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam
pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses
pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam
endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan
cat
safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah
muda pada sel vegetatifnya (Prescott, 2002)
Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya :
Gambar B.1 Tipe Endospora
Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia,
Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Contoh bakteri Gram negatif
adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll.
Gambar B.2 Berbagai Bentuk Bakteri.

E. coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 micrometer dan
diamater 0.5 micrometer. Volume sel E. coli berkisar 0.6-0.7 micrometer kubik. Bakteri ini
termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. Kita mungkin
banyak yang tidak tahu jika di usus besar manusia terkandung sejumlah E. coli yang berfungsi
membusukkan sisa-sisa makanan. Dari sekian ratus strain E. coli yang teridentifikasi, hanya
sebagian kecil bersifat pathogen, misalnya strain O157:H7. Bakteri yang namanya berasal dari
sang penemu Theodor Escherich yang menemukannya di tahun 1885 ini merupakan jenis bakteri
yang menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. Hampir semua rekayasa genetika
di dunia bioteknologi selalu melibatkan E. coli akibat genetikanya yang sederhana dan mudah
untuk direkayasa. Riset di E. coli menjadi model untuk aplikasi ke bakteri jenis lainnya. Bakteri
ini juga merupakan media cloning yang paling sering dipakai. Teknik recombinant DNA tidak
akan ada tanpa bantuan bakteri ini (Yalun, 2008).
Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri gram positif yang menghasilkan
pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya
tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 m. S. aureus
tumbuh dengan optimum pada suhu 37oC dengan waktu pembelahan 0,47 jam. S. aureus
merupakan mikroflora normal manusia[. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernafasan
atas dan kulit. Keberadaan S. aureus pada saluran pernafasan atas dan kulit pada individu jarang
menyebabkan penyakit, individu sehat biasanya hanya berperan sebagai karier. Infeksi serius
akan terjadi ketika resistensi inang melemah karena adanya perubahan hormon; adanya penyakit,
luka, atau perlakuan menggunakan steroid atau obat lain yang memengaruhi imunitas sehingga
terjadi pelemahan inang (Anonim, 2010).
Bacillus cereus merupakan bakteri Gram-positif, aerob fakultatif, dan dapat membentuk
spora. Selnya berbentuk batang besar dan sporanya tidak membengkakkan sporangiumnya. Sifatsifat ini dan karakteristik-karakteristik lainnya, termasuk sifat-sifat biokimia, digunakan untuk
membedakan dan menentukan keberadaan B. cereus , walaupun sifat-sifat ini juga dimiliki oleh
B. cereus var. mycoides , B. thuringiensis dan B. anthracis . Organisme-organisme ini dibedakan
berdasarkan pada motilitas/gerakan (kebanyakan B. cereus motil/dapat bergerak), keberadaan
kristal racun (pada B. thuringiensis ), kemampuan untuk menghancurkan sel darah merah
(aktivitas hemolytic ) ( B. cereus dan lainnya bersifat beta haemolytic sementara B. anthracis
tidak bersifat hemolytic ), dan pertumbuhan rhizoid (struktur seperti akar), yang merupakan sifat
khas dari B. cereus var. mycoides . dipaparkan bahwa bakteri bacillus cereus yang terdapat di
tanah sangat senang menempel pada biji-bijian seperti beras.Untuk itu, sebaiknya nasi yang tidak
dimakan, disimpan saja dalam lemari es. Selain itu, dalam artikel ini dijelaskan bahwa produkproduk seperti chicken nugget, daging giling, daging olahan, ataupun ayam, juga perlu
diperhatikan, mulai dari proses pembelian, penyimpanan, dan juga saat pengolahan. Karena,
apabila kita salah mengelola proses-proses tersebut, bukan tidak mungkin akan menyebabkan
keluhan dalam pencernaan kita (Anggraini, 2009).

C.
1.
a)
b)
c)

ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang digunakan adalah :
Kaca objek bersih
Pembakar Bunsen/spiritus
Jarum inokulasi

d)
e)
f)
2.
a)
b)
c)
d)

Mikroskop
Hot plate
Bak pewarna
Bahan-bahan yang digunakan adalah :
Pewarna kristal violet, larutan iodium, alcohol-aceton, malakit hujau
Minyak imersi
Air suling
Isolat / biakan : Bakteri Stapilococcus aureus, Bakteri Bacillus cereus, E. coli, dan Isolat X

D.
1.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)

CARA KERJA
PEWARNAAN GRAM
Membersihkan 2 (dua) kaca objek
Meneteskan aquades diatas kaca objek
Membuat apusan bakteri e.coli dan Stapilococcus aureus dengan teknik steril
Membiarkan apusan mengering diudara
Melakukan fiksasi panas diatas nyala Bunsen beberapa kali
Mengaliri apusan dengan pewarna kristal violet dan diamkan selama 60 detik (1 menit)
Mendekolorisasi dengan alcohol 95%. Tambahkan reagen setetes demi setetes hingga kristal
violet tidak tercuci lagi dari apusan
Megaliri dengan air yang mengalir
Memberi pewarna kontras dengan safranin, diamkan selama 30 detik
Mencuci dengan air yang mengalir
Mengeringkan diatas kertas saring, amati dibawah mikroskop

h)
i)
j)
k)
2.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
E.
1.

PEWARNAAN SPORA
Membersihkan kaca objek dari lemak dan kotoran
Membuat apusan bakteri Bacillus cereus dengan teknik aseptic
Membiarkan mengering diudara
Mengaliri apusan dengan pewarna Malachite green dan letakkan diatas pemanas selama 60 detik
(1 menit). Jika pewarna mulai mengering, kembali meneteskan.
Mengambil preparat dari pemanas, mendinginkan dan mencuci dengan air mengalir.
Mewarnai dengan pewarna kontras safranin selama 30 detik.
mengeringkan diatas kertas isap, dan mengamati dibawah mikroskop
HASIL PENGAMATAN
Pewarnaan Gram
No
Nama Bakteri
Bentuk
.
1.
E. Coli

Bentuk batang
pendek

Bakteri
gram
negatif
2.
Stapilococcus
aureus

Bentuk coccus
rantai


3.

Bakteri gram positif

Isolat X
Bentuk batang
Bakteri gram positif

2. Pewarnaan Spora
No.
Nama Bakteri
1.
Bacillus cereus
Bentuk batang dan
berspora
2.
Isolat X
Bentuk batang dan
berspora

Bentuk

F. PEMBAHASAN

1.
2.
3.
4.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki
membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50 nm) sedangkan bakteri negatif
lapisan peptidoglikan gennya tipis (1-3 nm).
Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:
Larutan violet kristal sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.
Lugol sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama
Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan
cat utama
Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan
warna cat utamanya.
Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif sama-sama
berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet
sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol
warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram positif
tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan
kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada gram positif dinding sel dehidrasi, pori
berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasma sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin,
bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram positif melewatkannya.

Hasil pengamatan pada bakteri yang diberi pewarnaan menunjukkan :

1. Bakteri E. coli
Hasil pewarnaan terhadap bakteri E. coli mennjukkan bahwa pada saat ditetesi dengan larutan
Kristal violet maka berwarna ungu artinya bahwa zat tersebut terikat oleh peptidoglikan bakteri.
Selanjutnya diberi lugol yang bertujuan untuk mengintensifkan cat utama (Kristal violet),
kemudian ditetsi dengan akohol yang bertujuan untuk melunturkan cat utama. Pengamatan pada
bakteri E. coli, etanol mampu melunturkan cat utama sehingga pada saat pengecatan dengan
safranin sel menyerap warna tersebut. Hal ini berarti bahwa bakteri E.coli memiliki membran
yang dilapisi oleh peptidoglikan yang lebih tipis. Dari ciri yang diperoleh pada pengamatan
tersebut maka disimpulkan bahwa bakteri E. coli merupakan bakteri gram negatif. Pada gram
negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristaliodin keluar sel, hal tersebutlah yang menyebabkan hilangnya warna ungu pada sel tersebut.
Selanjutnya pengamatan dibawah mikroskop menunjukkan bahwa bentuk bakteri E. coli adalah
batang pendek.
2. Bakteri Stapiloccocus Aureus
Pada pengecatan bakteri ini menunjukkan bahwa pengecatan dengan Kristal violet memberikan
warna ungu, kemudian dengan lugol yang berfungsi untuk mengintensifkan cat utama.
Selanjutnya bakteri tersebut ditetesi alcohol yang bertujuan untuk melunturkan cat utama. Dan
yang terakhir pengecatan dilakukan dengan safranin untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah
kehilangan warna cat utamanya. Pengecatan dengan alkohol tidak dapat melunturkan cat utama
(sel tetap berwarna ungu) sehingga pada saat pangecatan dengan safranin sel tidak akan
menyerap warna tersebut. Dari ciri tersebut maka dapat disimpulkan bahwa Stapiloccocus
Aureus adalah bakteri gram positif. Pada bakteri garm positif dinding sel dehidrasi, pori
berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasma sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin,
bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya. Selanjutnya dengan
menggunakan mikroskop, dapat ditentukan bentuk bakteri tersebut. Bakteri ini berbebtuk coccus
berantai.
3. Bakteri Basilus Cereus (Pewarnaan Endospora)
Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Karena
kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka
endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.
Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna
spesifik

dan

yang

biasa

digunakan

adalah

malachite

green.

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai,
zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora
secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora,
endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini
merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan
malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan
menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya.

Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop pada pewarnaan spora terhadap bakteri
Bacillus cereus, diperlihatkan bahwa bakteri Bacillus cereus memiliki spora yang berupa
endospora, yaitu spora yang dihasilkan di dalam sel vegetatif. Pada pewarnaan ini, spora dari
bakteri Bacillus cereus berwarna hijau, dan tampak berbentuk oval. Sel vegetative bakteri
berwarna merah.
4. Isolat X
Isolat X adalah isolate yang berasal dari lingkungan yang telah diisolasi pada percobaan
sebelumnya (berasal dari telapak tangan).
Dengan menggunakan prosedur yang sama seperti di atas, pada pewarnaan gram terhadap isolat
X menunjukkan bahwa sel pada isolate tersebut merupakan bakteri gram positif, meskipun hasil
pengamatan dengan mikroskop terlihat bahwa sel tersebut transparan. Hal ini dapat saja terjadi
akibat dari pelunturan warna cat karena membiarkan alcohol terlalu lama pada isolate tersebut.
Sedangkan pada pewarnaan spora terlihat bahwa bakteri pada isolat tersebut memiliki spora dan
bentuk sel berupa batangan.
G. KESIMPULAN

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Berdasarkan tujuan percobaan dan pengamatan yang telah dilakukan, maka dapat
disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
Pewarnaan struktur sel bakteri (pewarnaan gram) dilakukan dengan cat Kristal violet sebagai cat
utama, lugols iodine yang mengintensifkan cat utama, alcohol sebagai peluntur dan safranin,
Pada pewarnaan spora digunakan malachite green.
Bakteri e.coli termasuk bakteri gram negatif dan bakteri Stapilococcus aureus termasuk bakteri
gram positif
Sel bakteri Stapilococcus aureus berbentuk coccus yang berantai (stapilococcus), dan sel bakteri
E. coli, B. sereus bertebntuk batang.
Bakteri Bacillus cereus mempunyai spora yang berbentuk oval.
Bentuk isolat X adalah batang, merupakan bakteri garam positif dan mempunyai spora.

DAFTAR PUSTAKA
Anggraini.
D.
2009.
Bakteri
penyebab
http://id.shvoong.com/medicine-and-health di akses pada 4 Mei 2011

diare.

Anonim. 2011. Petunjuk Praktikum Biologi. Program Magister Pendidikan IPA. Universitas Mataram.
Mataram
Anonim, 2010. Stapiloccocus. http://id.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus di akses pada 4 Mei
2011
Arif, P. 2011. Pengecatan Gram. http://parahrif.blogspot.com/011/04/pengecatan-gram.html. diakses
pada 4 Mei 2011
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta
Caray. 2008. Pewanaan Bakteri. http://makalahdanskripsi.blogspot.com. Di akses pada 4 Mei 2011
Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com. Diakses pada 4 Mei 2011
Junaidi. W. 2010. Pewarnaan gram. http://wawan-junaidi.blogspot.com. Di akses pada 4 Me1 2011
Musyappalaf, R. 2010. Pewarnaan spora bakteri. http://ripanimusyaffalab.blogspot.com di akses pada
4 Mei 2011
Suriawiria,

U.

1985.

Mikrobiologi

Dasar

dalam

Praktek.

Gramedia.

Jakarta.

Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.
Yalun. 2008.Mengenal Bakteri E.coli. http://yalun.wordpress.com/2008 diakses pada 4 mei 2011
Pengecatan Gram
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan
diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan
medium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur
bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna,
cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk
pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan
sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk
menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Anonim, 2007)
Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan
gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan
sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi
gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi
lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai

dengan pemberian pewarna basa, kristal violet. Larutann iodine kemudian

ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi
alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat senyawa kristal violet-iodine, tetap
berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah
terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan, sehingga
sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkan
sel gram positif terlihat dalam warna biru (Jawetz, etc. 2001).

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram, pada tahun
1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri
Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan
Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
Mycoplasma sp.
Bakteri yang dapat mengikat
cat
, menjadi berwarana violet jika dilihat dengan mikroskop, adalah bakteri gram positif. Bakteri
yang lain yang tidak dapat mengikat cat adalah bakteri gram negatif dan nampak berwarna merah
muda.
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di
laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi
mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan
tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat
dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter
untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur.
1.2 Tujuan Praktikum

Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami morfologi bakteri dengan cara melakukan
pengecatan.

Mahasiswa dapat mengetahui cat yang umum dipakai dalam pengecatan bakteri yaitu
pengecatan Gram.
Mahasiswa dapat mengetahui perbedaan antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Berdasarkan tehnik pengecatan gram, dibagi menjadi bakteri gram positif
(dinding sel peptidoglikan tebal) dan gram negatif ( dinding sel peptidoglikan tipis dan tertutup
oleh sebuah lapisan lipopolisakarida). Christian gram, bakteriolog Denmark, pada tahun 1843
mengelompokkan bakteri menjadi dua golongan berdasarkan reaksi pengecatan. Kedua golongan
tersebut, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri
yang tidak dapat dihilangkan warnanya dengan etil alkohol 95% setelah pengecatan dengan
violet dan iodine menghasilkan warna ungu. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang warnanya
mudah dihilangkan dengan cara sama sehingga sulit dilihat oleh mikroskop, oleh karena itu perlu
pengecatan counterstain untuk memunculkan warna merah sehingga dapat dilihat oleh
mikroskop (Sudjino, 2007).
Sel bakteri secara keseluruhan atau bagian dari sel memungkinkan untuk di cat
dengan berbagai cat atau warna. Kemampuannya untuk mengikat cat tergantung atas spesies
bakteri. Cat yang umum dipakai adalah cat Gram. Bakteri yang dapat mengikat cat, menjadi
warna violet jika dilihat dengan mikroskop adalah bakteri Gram positif, bakteri yang lain yang
tidak dapat mengikat cat adalah bakteri Gram negatif dan Nampak berwarana merah muda
(Gaman, 1992).

BAB III

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

3.1 Materi Praktikum
A. Alat Praktikum
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
1. Tabung Reaksi
2. Pipet
3. Cawan petri
4. Kertas label
5. Incubator
6. Kapas
7. Slide Glass
8. Ose
9. Lampu Bunsent
10. Mikroskop Cahaya
11. Jembatan Pengecatan
B. Bahan Praktikum
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
1. NACL
2. Media NA
3. Sampel (Kuning telur yang sudah di pasteurisasi dengan suhu 37O C selama 5 menit)
4. Crystal Violet (Cat Dasar)
5. Cairan Lugol (Cat Penguat)
6. Etanol 96%
7. Vuchen

3.2 Metode Praktikum

1. Siapkan alat dan bahan
2. Ambil satu tetes NaCl fisiologis dengan memakai pipet kemudian teteskan pada slide.
3. Ambil biakan bakteri atau mikroba (satu mata ose) kemudian campur dengan merata dengan
NaCl, kemudian setelah tercampur lakukan fiksasi (pemijaran) di atas api, panaskan sampai
mengering agar mikroba mati.
4. Setelah itu lakukan pengecatan dengan:

a.

Gentian violet atau Kristal violet yang berguna sebagai cat dasar
Caranya:
preparat yang sudah kering letakkan pada jembatan pengecatan, dan teteskan 1 tetes kemudian
ratakan dan diamkan selama satu menit
lakukan pencucian dengan air mengalir dan tiriskan
b. pengecatan dengan lugol sebagai cat penguat dengan cara yang sama seperti pada pengecatan
pertama.
c. Pengecatan dengan Etanol 96 % sebagai cat peluntur dengan cara yang sama seperti pada
pengecatan sebelumnya dengan waktu 15 detik
d. Pengecatan dengan vuchin dengan cara sama seperti pengecatan sebelumnya dengan waktu 90
detik atau 2 menit
5. Lakukan pengeringan dengan diangin-anginkan sampai kering
6. Lakukan pemeriksaan warna morfologi morfologi di bawah mikroskop cahaya dengan
pembesaran 100x oil emertion sebanyak satu tetes untuk memperjelas objek.
7. Bersihkan dan kembalikan alat dan bahan pada tempatnya.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Praktikum
Hasil pengamatan dengan mikroskop (pembesaran 100 x dan ditambahkan oil imersil
sebanyak satu tetes).

4.2 Pembahasan
Dalam praktikum ini dilakukan percobaan mengenai Pengecatan Gram. Metode
pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram, pada tahun 1884. Pengecatan Gram
merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk
kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang
diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat
digunakan untuk identifikasi awal.
Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis zat pewarna, cara ini
disebut pewarna sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarna sederhana
misalnya biru methilen. Pewarna bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu :
pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan structural, dan pewarnaan untuk
menguji adanya komponen tertentu di dalam sel.
Dalam praktikum ini dilakukan empat kali pengecatan yaitu: cristal violet yang
berfungsi sebagai cat dasar, setelah itu pengecatan dilakukan dengan cairan lugol yang berfungsi
sebagai cat penguat kemudian dengan etanol 96% sebagai cat peluntur dan pengecatan dengan
vuchin yang berfungsi sebagai cat penutup.
Sel bakteri secara keseluruhan atau bagian dari sel memungkinkan untuk di cat
dengan berbagai cat atau warna. Kemampuannya untuk mengikat cat tergantung atas spesies
bakteri. Cat yang umum dipakai adalah cat Gram. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri
dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan
reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Setelah melakukan praktikum dan diamati dengan mikroskop dengan pembesaran
100 x dan ditambahkan oil imertion sebanyak satu tetes untuk memperjelas objek pada
mikroskop sehingga dihasilkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri yang dapat
mengikat cat menjadi berwarana violet jika dilihat dengan mikroskop, adalah bakteri gram
positif. Bakteri yang lain yang tidak dapat mengikat cat adalah bakteri gram negatif dan nampak
berwarna merah muda.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang sudah dilaksanakan dapat disimpulkan beberapa hal sebagai
berikut:
1. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap pengecatannya.
2. Bakteri yang dapat mengikat cat, menjadi warna violet jika dilihat dengan mikroskop adalah
bakteri Gram positif dan bakteri yang lain yang tidak dapat mengikat cat adalah bakteri Gram
negatif dan nampak berwarana merah muda.
5.2 Saran
Untuk mendapatkan hasil praktikum yang baik diharapkan kepada semua praktikan
datang tepat waktu, mengikuti praktikum sesuai dengan arahan dari co. assisten dan tata tertib
yang ada dan memperhatikan keselamatan kerja selama kegiatan praktikum berlangsung.

DAFTAR PUSTAKA
Gaman, P.M. 1992. Pengantar Ilmu Pangan Nutrisi dan Mikrobiologi. Yogyakarta:
Gadjah Mada University Press
Sudjino, dkk. 2007. Biologi. Jakarta: Intan Pariwara

BAB II
ACARA II
PENGECATAN BAKTERI
A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Seorang mikrobiologiwan apabila akan mendiagnosis suatu penyakit haruslah
memeriksa suatu mikroorganisme secara amat terperinci. Untuk memerinci suatu
mikroorganisme tersebut maka dapat dilakukan dengan pengecatan bakteri.
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di
laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.
Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas
terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi
awal.
Supaya bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipalajari maka tingkat sel
kontras itu dapat ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud dengan
pewarnaan disini adalah perlakuan dengan zat warna yang mengikat secara selektif
baik seluruh sel maupun komponen sel tertentu, sehingga dapat menghasilkan
penyerapan cahaya yang jauh lebih besar. Kebanyakan perlakuan pewarnaan dapat
membunuh sel oleh karena itu sebelum sel itu difiksasi dengan perlakuan memakai
zat kimia yang bertujuan untuk mengurangi perubahan struktur sel yang telah mati.
Zat untuk fiksasi yang biasa digunakan adalah asam osmat dan aldehid, terutam glutar
aldehid. Salah satu bakteri yang sering diamati dengan menggunakan pewarnaan
adalah bakteri gram. Warna yang terlihat di mikroskop adalah menunjukkan jenis
bakteri gram tersebut positif atau negative
2. Tujuan praktikum
Tujuan dilaksanakannya praktikum ini adalah untuk mengetahui cara
pengecatan gram dan mengamati bentuk serta sifat bakteri terhadap
pengecatan gram.

B. Tinjauan pustaka
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan
diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan
medium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur
bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara
ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk
pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan
sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk
menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Anonim, 2007)
Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap
pewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan
dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang
berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada
kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda.
Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal
violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru
pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat
senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang
oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna
merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan
mengambil warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru
(Jawetz, etc. 2001).
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di
laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.
Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas
terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi
awal.
Cat
Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam yang masing-masing
mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda, yaitu:
1. Cat Gram A
Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A
merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat
diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.
2. Cat Gram B
Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat
atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme
target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih
baik (lebih kuat).
3. Cat Gram C
Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat
sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan yang pertanama
mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol.

Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat
demikian disebut bakteri Gram positif. Sedangkan bakteri akan tidak berwarna,
karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh
alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.
4. Cat Gram D
Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini
berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder
mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat
Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan yang pertama bakteri Gram positif akan tetap
berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi
mengikat cat Gram D. Sedangkan yang kedua bakteri Gram negatif akan berwarna
merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu
mengikat cat Gram D.
pengecatan gram mempunya kelebihan dimana pengecatan Gram penting
sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti
definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap
antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan
yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Selain itu kadang-kadang morfologi
bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada
pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus
(nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi
gonore. Disamping itu pengecatan gram juga mempunyai kekurangan dimana
pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari
104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan
serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan
mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan
pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis (http://septa-ayatullah.blogspot.com)
Untuk memberi ciri pada beragai kelompok bakteri perlu dipahami bahwa
semua cirri tidak sama pentingnya bagi semua kelompok. Sebagai contoh, peaksi
pewarnaan gram penting bagi bakter batang dan kokus tetapi bukanlah cirri pembeda
bagi Spiroketa. Ada tidaknya flagella serta penataannya penting bagi beberapa
kelompok sedang bagi yang lain tidak. Untuk beberapa kelompok , sifat-sifat
biokimia lebih berarti daripada sifat morfologi. Karena itu, untuk mencirikan
kelompok bakteri, janganlah mengharapkan adanya sifat-sifat yang sama (Peltzar,
1986).
Bentuk bakteri bermacam-macam. Ada yang bulat (tipe kokus) dengan garis
tengah 0,15-1mikorn. Ada yang berbentuk batang atau slindris panjang atau pendek
(tipe basil) dan ada yang berbentuk slindris, spiral panjang atau pendek (spirillum)
yang garis tengahnya 0,3-3 mikron, sedangkan panjangnya 1 sampai lebih dari 6

mikron. Umumnya bakteri bersel tunggal tidak mempunyai klorofil serta berkembang
biak dengan cara membelah dan spora. Tiap sel dikelilingi oleh dinding sel atau
membrane yang menyerupai lendir. Jika berkelompok, wujudnya seperti lendir yang
kental dan berbentuktidak teratur, ada yang panjang, bulat, atau lapisan tipis seperti
buih. Bakteri itu ada yang inaktif atau tidak dapat bergerak. Ada pula bakteri yang
bisa berenang atau bergerak akibat adanya bulu-bulu yang bisa bergetar (Pracaya,
2008).
Ada kalanya suatu sediaan perlu diwarnai dua kali. Setelah zat warna yang
pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci degnan alcohol, kemudian ditumpangi
dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika sediaan itu
kemudian kita cuci dengan air, lalu dengan alcohol, maka dua kemungkinan akan
terjadi. Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang menampak ialah zat
warna yang asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif.
Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak nampak.
Maka sediaan (bakteri) kita katakan gram negative. Adapula zat bakteri pada usia
tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negative atau sebaliknya. Bekteri
yang demikian itu disebut dengan gram variable (Dwidjoseputro, 1985).

C. Metodelogi praktikum
1. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 27 April 2010 di
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Mataram.
2. Alat dan Bahan Praktikum
Alat-alat yang digunakan adalah:
1. Pipet tetes
2. Gelas benda
3. Jarum ose
4. Mikroskop
5. Lampu bunsen
6. Pipet tetes
7. Tabung reaksi
8. Tissue, dan ember
Bahan-bahan yang dibutuhkan adalah:
1. Isolate bakteri dari hasil purifiksi
2. Air steril
3. Alcohol 70%
4. Cat nigrosin atau tinta cina (Gram A),
5. Larutan Mordan (Gram B)
6. Larutan pluntur (Gram C)
7. Cat penutup (Gram D)

3. Cara Kerja
a. Gelas benda yang akn digunakan dibersihkan terlebih dahulu dengan
alcohol
b. Diambil suspensi biakan murni masing-masing bakteri secara aseptis
dengan ose dan diletakkan pada permukaan gelas benda.
c. Ditambahkan satu tetes larutan cat nigrosin atau tinta cina (Gram A) pada
suspensi bakteri tersebut dan campurkan dengan batang gelas hingga
merata. Ratakan campuran tersebut dengan batang gelas sehingga
berbentuk lapisan tipis. Preparat selanjutnya dikering anginkan.
d. Setelah dibiarkan beberapa saat, dilakukan pencucian dibawah air dan
dikering anginkan.
e. Diteteskan larutan Mordan (Gram B) dan didiamkan selama 1-2 menit,
kemudian dicuci di air mengalir din dikering anginkan.
f. Diteteskan larutan pluntur (Gram C) dan dibiarkan selama 20-30 detik,
kemudian dicuci di air mengalir dan dikering anginkan.
g. Diberi cat penutup (Gram D) dan dibiarkan selama 2 menit, kemudian
dicuci di air mengalir dan dikering anginkan.
h. Diamati dibawah mikroskop dan diamati perbedaan antara bakteri Gram
positif dengan Gram negative.
D. Hasil pengamatan
Table 2. Pengamatan bakteri hasil pengecatan meliputi: warna dan bentuknya
dibawah mikroskop
Sampel
Tanah
Bakteri/Seri
Pengenceran
Bentuk Warna Keteragan
Tanah Kebun 10-6 : A
:B
Streptobasil Merah Gram negatif
Streptococcus Merah Gram negatif
10-7 : A
:B
Streptococcus Merah Gram negatif
Streptobasil Ungu Gram positif
Tanah TPA 10-6 : A
:B
:C
10-7 : A

Streptococcus Ungu Gram positif

Streptococcus Ungu Gram positif
Streptobasil Ungu Gram positif
Streptococcus Merah Gram negatif
Tanah Sawah 10-6 : A Streptococcus Merah Gram negatif
E. Pembahasan
Pengecatan bakteri yang didapat dari hasil purifikasi pada acara I dilakukan
pada tanggal 27 april 2010. Dari hasil pengecatan bakteri yang dilakukan dapat
dijelaskan bahwa pada bakteri yang diisolasi dari tanah kebun dengan seri
pengenceran 10-6 ulangan I, diperoleh bakteri berbentuk basil (batang) yang berderet
seperti rantai (streptobacil) berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri
tersebut gram negative. Sedangkan pada ulangan II didapat bakteri berbentuk bulat
berantai seperti tasbih (streptococus) dan berwarna merah yang menunjukkan bahwa
bakteri tersebut gram negative. Sementara dari seri pengenceran 10-7 ulangan I
diperoleh bakteri berbentuk streptococcus yang berwarna merah (gram negatif).
Sedangkan pada ulangan II diperoleh bakteri berbentuk strepto bacil yang berwarna
ungu pula (gram positif).
Pada bakteri yang diisolasi dari tanah disekitar tempat pembuangan akhir
(TPA) dengan seri pengenceran 10-6 ulangan I, diperoleh bakteri berbentuk cocus
(bulat) yang menyerupai tasbih (streptococus) berwarna ungu yang menunjukkan
bahwa bakteri tersebut gram positif. Pada ulangan II didapat bakteri dengan bentuk
yang sama yaitu bulat berantai seperti tasbih (streptococus) yang berwarna ungu
menunjukkan bahwa bakteri tersebut gram positif. Sedangkan pada ulangan III
didapatkan bakteri dengan bentuk streptobacil yang berwarna ungu (gram positif).
Sementara dari seri pengenceran 10-7 ulangan I diperoleh bakteri berbentuk
streptococcus yang berwarna merah (gram negatif).
Pengamatan menggunakan alat bantu mikroskopseperti kegiatan diatas
dilakaukn pula pada bakteri yang diisolasi dari tanah sawah dengan seri pengenceran
10-6 makandiperoleh bakteri berbentuk cocus (bulat) yang menyerupai tasbih
(streptococus) berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut
gramnegatif.
F. Kesimpulan
Dari pengamatan yang dialakukan dapt disimpulkan bahwa:
1. Bentuk bakteri yang bersifat soil born pada tanaman umumnya berantai
panjang
2. Bakteri yang paling banyak dijumpai pada semua sampel tanah yang
digunakan (tanah sawah, tanah kebun dan TPA) adalah bakteri yang
berbentuk strptococus gram negative.
3. Kebanyakan bakteri yang berifat soil born akan menyerap cat penutup pada
proses pengecatannya (gram negatif)

Pengecatan Gram. Pengecatan ini pertama kali dikemukan oleh Cristian Gram (1884). Dengan
pengecatan ini film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentinviolet
(karbol violet, karbol metal violet) dan didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dengan
larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama, sampai tingkat pengecatan ini
selesai, semua bakteri akan berwarna ungu, selanjutnya preparat di dekolorisasi dengan alkohol
atau campuran alkohol dengan aseton sampai semua zat warna tampak luntur dari film. Setelah
dicuci dengan air, preparat diberi warna kontras (counterstan), seperti safranin korbol tuksin
encer, air tuksin, tengguli bismack, dan lain-lain. Diantara bermacam-macam bakteri yang dicat,
ada yang dapat menahan zat warna ungu (metil violet, kristal violet, gentian violet) dalam
tumbuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol atau aseton. Dengan demikian tubuh
bakteri itu tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat warna kontras,
warna ungu itu tetap dipertahankan. Bakteri yang memberi reaksi semacam itu dinamakan
bakteri gram positif, sebaliknya, bakteri tidak dapat menahan zat warna setelah dikolorisasi
dengan alkohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan zat
kontras, akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi
semacam ini dinamakan bakteri gram negatif (Irianto, 2006).