BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya, yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Hastowo, 2002).
Pengenalan bentuk mikroba, kecuali mikroalgae harus dilakukan
pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Tujuan dari
pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri,
memperluas ukuran jasad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan
melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau
kimia jasad dapat diketahui (Hadioetomo, 1991).
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena
banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Hastowo, 2002).

B. Rumusan Masalah
Apa yang dimaksud dengan pewarnaan sederhana dan bagaimana prosedur
kerja pewarnaan sederhana ?
C. Tujuan
Tujuan dilakukan praktikum ini adalah untuk mempelajari pewarnaan
sederhana terhadap mikroba dan mahasiswa dapat mengetahui bagaimana cara
pewarnaan sederhana .
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan
rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuchsin yang mana pewarnaan
sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan (Dwidjoseputro, 1994).
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan
tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam
pewarnaan positif adalah metilen biru dan air fuchsin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan
ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan tinta cina.
Pewarnaan sederhana merupakan tekhnik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,larena
selain bakteri itu tidak berwarna juga tranparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu tekhnik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamat. Oleh karena itu tekhnik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Hadioetomo, 1991).
 Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen.Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarna.Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
asam dan pewarna basa (Hastowo, 2002).
Pewarna asam dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif.
Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif,
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka
sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam
misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin, dll (Hastowo, 2002).
Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan
diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat. Contoh
dari pewarna basa misalnya metilen biru, kristal violet, safranin, dan lain-lain. Teknik
pewarnaa asam basa ini hanya menggunaka satu jenis senyawa pewarna, teknik ini
disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati
morfologi, baik bentuknya maupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah
pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu
jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan
gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.Juga diperlukan untuk
mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora, dan nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku sebagai berikut:
Mempersiapkan kaca objek.Kaca objek ini harus bersih dan bebas lemak,
untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.Mempersiapkan apusan, apusan
yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.Apusan ini
berasal dari biakan cair atau padat.Biakan cair suspensi sel sebanyak satu atau dua
mata ose dan diletakkan ke kaca objek.Lalu diapuskan pada kaca objek.biarkan
mengerig di udara atau diatas api kecil dengan jarak 25 cm (Hastowo, 2002).
 Biakan padat.Bakteri yang dikulturkan pada medium padat tidak dapat
langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan
setetes air pada kaca objek, lalu dengan jarum inokulasi ambil bakteri dari biakan
padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering di udara.Fiksasi
dengan pemanasan. Apusan bakteri pada kaca objek dapat dilakukan diantaranya
dengan cara memanaskan diatas api (Pelczar,1986).
Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini,
disebut endospora.Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan
nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia.
Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan
keras.Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk
mewarnainya.Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat
menembus endospora.Tetapa sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk
dihilangkan.Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang
digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya.
Faktor yang mempengaruhi pewaraan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.Suatu preparat
yang sudah suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer.Bakteri-bakteri
seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi
suatu spesies (Pelczar,1986).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam
yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan
pengecatan struktural.Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain
dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnan diferensial.Sedangkan pengecatan struktural hanya bisa
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengectan endospora, flagela dan pengecatan
kapsul (Pelczar,1986).
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur, dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri.Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut di suspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi adalah dengan metode pengecatan atau pewarnaan, hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkain pengecetan. (Jimmo, 2008)
Sel bakteri dapat diamati dengan jelas jika menggunakan mikroskop dengan
perbesaran 100 x 10 yang ditambah minyak emersi.Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat.Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri.Zat warna dapat
mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan.Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa.Pada
zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor
dan mempunyai muatan positif (dwidjoeseputro, 1994).
Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain
cristal violet, methylen blue, safranin, Base Fuchsin, Malachite Green, dll. Sedangkan
zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll ( Irawan, 2008).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromotofiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan
bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi, pewarnaan dan
penggunaan warna penutup.Suatu preparat yang sudah menyerap zat warna,
kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus.Sebaliknya terdapat
juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri ini disebut bakteri
tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi suatu spesies (dwidjoeseputro, 1994)
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus
diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal terperinci
tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion
negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
 BAB III
METODE PERCOBAAN

A. Waktu dan Tempat

1. Waktu : 13.00 – 15.00 WITA
2. Tempat : Laboratorium Mikrobiologi DIII Analis Kesehatan
B. Alat dan Bahan
1. Alat :
a. Mikroskop
b. Gelas objek
c. Ose
2. Bahan
a. Aquades
b. Spritus
c. Tissue
d. Larutan (Methylen blue, Safranin, Crystal violet)
C. Prosedur kerja
1. Dibersihkan object glass dengan kapas atau jika perlu tulislah kode atau nama
bakteri pada sudut object glass.
2. Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet
tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan
dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan
dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi
akuades dan disebarkan supaya sel merata.
3. Dikeringkan ulasan tersebut sambil difiksasi dengan api bunsen (lewatkan di
atas api 2-3 kali).
4. Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna
(dapat digunakan Methylen blue, Safranin, Crystal violet) dan tunggu kurang
lebih 30 detik.
5. Cat dibuang, dicuci dengan air mengalir sampai bersih.
6. Dikeringkan dengan tissue dan lihat di bawah mikroskop objectif perbesaran
100 x10
 BAB IV
HASIL PENGAMATAN

Gambar Keterangan
 BAB V
PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan pewarnaan sederhana,

pewarnaan sederhana yaitu teknik pewarnaan yang menggunakan satu macam zat
warna. Tujuan dilakukan pewarnaan sederhana pada bakteri yaitu untuk
meningkatakan kontras mikroorganisme dengan sekelilingnya, dan melihat bentuk,
ukuran dan penataan mikroorganisme.

Zat warna yang sering digunakan yaitu zat warna yang bersifat basa yakni
methylan blue, gentian violet, safranin, hijau malakit, dan base fuchsin. Zatwarna
basa mempunyai muatan yang bersifat positif, sedangkan zat warna basa mempunyai
muatan yang bersifat negatif, karena zat arna basa bersifat positif maka zat warna
basa sering digunakan sebagai bahan untuk pewarnaan yang bersifat negatif, sehingga
digunakan zat warna yang bersifat positif yaitu zat warna basa.

Pada percobaan kali ini melakukan pewarnaan sederhana dengan

menggunakan biakan Stapilococcus aureus. Stapilococcus aureus adalah bakteri
kokus gram positif, susunan bergerombol dan tidak teratur seperti anggur. Sebelum
melakukan pewarnaan, kaca preparat disterilkan diatas api bunsen agar kaca preparat
menjadi steril dan terbebas dari kotoran lain. Ditetesi HCl 0,1 N diatas kaca preparat
bertujun untuk meratakan sel bakteri, kemudian difiksasi dengan cara dilewatkan
diatas api bertujuan untuk membunuh mikroba tanpa meghancurkan strukturnya,
meratakan sel-sel mikroba pada objek glass. Zat warna yang digunakan yaitu
methylan blue. Methylan blue ditetesi diatas objek glass yang telah berisi sel-sel
mikroba. Tujuan ditetesi methylan blue tersebut agar pada saat pengamatan bentuk
bakteri yang diamati dapat terlihat dengan jelas. Setelah 30 menit , dicuci methylan
blue tersebut dengan aquades bertujuan untuk menghilangkan zat warna yang telah
diserap mikroba. Pada saat mencuci, kaca preparat jangan dibilas agar sel-sel mikroba
yang telah menyerap zat warna methylan blue tetap melekat pada kaca preparat.
Kemudian dikeringkan lalu ditetesi oil emercy bertujuan agar melindungi lensa
objektif mikroskop dan juga aga sel mikroba terlihat dengan jelas saat diamati.
Kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 yaitu 100 pada lensa
objektif, dan 10 pada lensa okuler. Dilihat bentuk serta struktur kemudian amati
dengan jelas.

Pada percobaan kali ini pewarnaan sederhana yang dilakukan pada bakteri
stapilococcus aureus dilihat dengan mikroskop dengan perbesaran 1000, 100 untuk
lensa objektif dan 10 untuk lensa okuler yaitu didapatkan hasil berbentuk bulat-bulat
seperti buah anggur atau stapilococcus. Hal ini menunjukkan bahwa pengamatan
yang dilakukan berbanding lurus dengan teori, bentuk bergerombol dan tidak teratur
seperti anggur atau berbentuk stapilococcus.

Beberapa faktor kesalahan pada praktikum yaitu antara lain pemberian zat
warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak terlihat, kurang maksimalnya dalam
proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan pada saat proses
pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat
menyebabkan bakteri larut terbawa air sehingga tidak ada sel bakteri yang tersisa
untuk diamati di bawah mikroskop.

Hal-hal yang harus diperhatikan pada percobaan pewarnaan sederhana yaitu

membersihkan objek glass harus bersih dan bebas dari lemak dan debu yang
menempel, pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak , karena jika
terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan
tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun, hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan
bentuknya satu persatu menjadi tidak jelas.
 BAB VI
PENUTUP
A. Kesimpulan
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat
warna untuk mewarnai organisme tersebut
B. Saran
Sebaiknya saat praktikum alatnya di perbanyak sehingga semua praktikan
mencoba sendiri-sendiri. Karena jika praktikan bisa mencoba sendiri-sendiri
itu lebih mudah untuk dipahami. Dan diharapkan alat-alat yang digunakan
harus dalam keadaan bersih.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 1992. Mikrobiologi. Erlangga. Jakarta

Hadioetomo. 1991. Mikrobiologi Dasar. Rineka Cipta. Bandung.

Sugyo Hastowo. 2002. Mikrobiologi . Rajawali Pers, Jakarta.

Pelczar. J. Michael dan Chan E.C.S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas

Indonesia. Jakarta