BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan
mikroskop dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang masih
hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan
diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat sebaiknya bakteri diwarnai dengan zat warna,
beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri juga dapat digunakan untuk
mengamati struktur bagian dalam sel. Dengan adanya pewarnaan terutama bakteri
yang mempunyai sel dengan ukuran yang retif kecil akan lebih mudah terlihat di
bawah mikroskop denagn menggunakan lensa objektif minyak imersi yang
mempunyai tingkat pembesaran yang relatif tinggi.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu
bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan
suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu
cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Beberapa cara pewarnaan gram atau pengecatan yang perlu diketahui dalam
mengamati morfologi terutama adalah pewarnaan sederhana, pewarnaan gram,
pewarnaan acid fast atau pewarnaan negatif. Sebelum melakukan pewarnaan
dilakukan pembuatan olesan (smear) dan fiksasi pada bakteri yang akan diamati.
Selain pewarnaan gram, untuk melihat sel-sel bakteri dapat juga dilakukan
pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif atau pewarnaan asam merupakan salah satu
teknik pewarnaan bakteri. Akan tetapi teknik ini bukan untuk mewarnai sel
bakteri, hanya mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Zat warna yang
digunakan tidak akan mewarnai sel, tetapi mewarnai lingkungan sekitar sehingga
sel bakteri tampak transparan. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel
bakteri cenderung bermuatan negatif dan senyawa pewarna juga bermuatan yang

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

sama sehingga akan ditolak oleh dinding sel. Pewarna yang biasa digunakan
antara lain nigrosin, eosin, dan asam pikrat. Tetapi kini nigrosin sudah tidak
digunakan dalam pewarnaan, dan diganti dengan tinta cina.
Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan praktikum kali ini dengan judul
percobaan yaitu Pewarnaan Negatif. Yang bertujuan untuk mengetahui bentuk
(morfologi) bakteri dengan mewarnai latar belakangnya.
B. TUJUAN PERCOBAAN :
1. Untuk dapat mengetahui prinsip pewarnaan negatif pada bakteri.
2. Untuk dapat mengetahui kegunaan pewarna tinta cina pada percobaan ini.
3. Untuk dapat mengetahui bentuk (morfologi) dengan mewarnai latar
belakangnya.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hamper tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan.
Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut
berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan (Dwidjoseputro, 2005).
Bakteri juga merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik.
Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan
kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup
sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah dalam proses
identifikasi bakteri (Pratiwi,S. 2008).
Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna
koloni. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993).
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di
dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis
biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil
pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka
penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi
sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun
biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe
metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test
yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Pratiwi, S. 2008).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang
beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel
spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

sampai 0,3 m. Bentuk bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan
spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat
pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran,
bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri
dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar
& Chan, 2007).
Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa
harus dengan cara-cara yang khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung,
menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain.Tetapi pengamatan dari
pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel
dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan
mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut
maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat
jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul ( Pelczar, 2007 ).
Prinsip dasar dari teknik pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan
yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram.
Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial
memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri
(Volk & Wheeler, 1984).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifatsifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan
warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna
pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di
antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Zat warna dapat mengabsorbsi dan
membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya
ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna
basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan
mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel.
Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base
Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo
Red dll (Irawan, 2008).

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

Pewarnaan negatif atau pengecetan negatif adalah pewarnaan yang

dilakukan bukan pada mikrobanya melainkan pewarnaan tersebut ditunjukan pada
latar belakang dari sel-sel mikroba. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam
seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,
tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada
permukaan bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar
belakang berwarna. Bahan pulas dipakai tinta-cina, karena itu sering juga disebut
pewarnaan tinta-cina. Pewarnaan Burri dipakai untuk mengetahui adanya
golongan spirochaetales dan juga untuk memperlihatkan adanya selubung (kapsul)
pada kuman-kuman yang tertentu seperti pada Diplococcus pneumoniae,
Klebsiella Frielander, dll (Hadiutomoto,1993).
Pada dasarnya pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai
bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi gelap, zat warna tidak akan
mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga bakteri
tampak transparan dengan latar belakang hitam. Pewarnaan negatif, metode ini
bukan untuk mewarnai bakteri tetapi latar belakngnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini
berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan
tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan
kimia, maka terjadi penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif atau pewarnaan asam dapat terjadi
karena senyawa pewarnaan berwarna negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral,
dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang
bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu dinding
sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta
cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin. Teknik ini berguna untuk
menentukan moffologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini di lakukan olesan tidak
mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia,
maka terjadi penyusutan dan salah satu bentuk agar penentuan sel dapat diperoleh

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

denagan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina
(Lay,1994).
Pada pewarnaan negatif, lingkungan yang berwarna hitam disebabkan oleh
pewarna yang digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna
dasar hitam. Hal ini telah sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa zat
pewarna asam membawa suatu muatan negatif, maka pada sel yang
permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat warna
ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel
akan tetap berwarna bening (Hadiutomo,1993).
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa
karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun
biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam
keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan
bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia
agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Selain itu, disebutkan juga bahwa bakteri merupakan organisme
mikroseluler yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna
(nigrosin) yang bermuatan negatif tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai
adalah lingkungan luarnya saja (Pratiwi,2008).

BAB III
METODE PRAKTIKUM

A. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
a. Mikroskop.
b. Kaca Preparat 2 buah
c. Pipet Tetes 2 buah.
d. Ose Bulat.
LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

e. Lampu Spiritus.
f. Korek api.
g. Pensil warna (merah,biru, dan ungu).
2. Bahan
a. Biakan bakteri C (Streptobasil)
b. Air garam fisologis steril (NaCI).
c. Larutan pewarna tinta cina.
d. Emersi Oil.
e. Alkohol 70%.
B. PRINSIP PRAKTIKUM
Adapun prinsip dasar dari pewarnaan ini yaitu berdasarkan pewarnaan tidak
langsung dengan hanya mewarnai latar belakangnya (kaca objek).
C. CARA KERJA
1. Buat suspense tebal dari bakteri C dengan air garam fisiologis pada salah satu
ujung dari kaca benda pertama.
2. Letakkan dengan satu tetes tinta cina didekat suspense bakteri tadi, lalu pelanpelan campur baik-baik suspense bakteri tersebut dengan tinta.
3. Letakkan kaca benda kedua dengan kemiringan 45 0 di depan campuran tadi,
lalu tarik ke belkang sampai campuran tinta merata pada ujung kaca benda II.
Segera dorong kaca benda II kea rah depan dengan rata dan cepat
4. Keringkan preparat ditas api dan lakukan fiksasi dengan melewatkannya 3 kali
pada nyala api.
5. Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 100, perhatikan dan
gambarkan morfologi bakteri dan latar belakangya yang dilihat pada
mikroskop.
BAB IV
HASIL PRAKTIKUM
A. TABEL PENGAMATAN

Morfologi Bakteri
Latar Belakang
Metode pewarnaan

: Bulat berantai ( Sterpto Coccus)

: Hitam
: Murah / mahal
Mudah / sukar dilakukan
Mengerjakan butuh waktu / cepat
LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

B. GAMBAR
C

BAB V
PEMBAHASAN

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen, sehingga tidak berwarna dan

hampir tidak terlihat karena tidak kontras dengan media dimana mereka hidup.
Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati
dengan mikroskop.
Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan
negatif. Pewarnaan negatif merupakan adalah cara pengamatan mikrobiologi yang
biasa dilakukan untuk membedakan specimen kecil dengan cairan optiknya .
Berbagai macan tipe morfologi bakteri seperti coccus, bacillus, dan sebagainya
dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna negative ini.
Tahap pertama pada Proses perwarnaan negatife itu sendiri, dilakukan
dengan membersihkan kaca objek dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak
terkontaminasi. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi
semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan
digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada pembakar spiritus
yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak
tercampur dengan bakteri yang akan di uji. Kemudian membuat tebal bakteri C,
dengan menggunakan air garam fisiologis pada salah satu ujungnya. Selanjutnya
teteskan tinta cina, dekat dengan suspensi. Ambil dan letakkan kaca objek kedua
dengan kemiringan 450 pada ujung kaca objek campuran tersebut. Lalu tarik
kebelakang kaca objek kedua tersebut sampai campuran tinta merata.
Tahap selanjutnya yaitu mengeringkan preparat tersebut diatas api
(mealkukan fiksasi) sebanyak 3 kali. Fiksasi dalam tahap ini bertujuan untuk
membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri,
melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna.
Kemudian amati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10100.
Pada pewarnaan negatif ini dapat diketahui bentuk luar dan karakteristik dari
bakteri yang sulit untuk diwarnai, sehingga hanya mewarnai latar belakangnya
saja. Adapun biakan Bakteri yang digunakan percobaan kali ini yaitu streptobasil
yang merupakan bakteri berbentuk batang yang berkelompok membentuk
menyerupai rantai.
Dan Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan negatif yaitu nigrosin (tinta
cina). Pewarna tinta cina tidak mewarnai bakteri, tapi mewarnai preparat sehingga
terlihat bakteri tersebut berwarna bening. Hal ini disebabkan karena tinta cina dan
bakteri sama-sama bermuatan negatif. Akibatnya, tinta cina langsung mewarnai
preparat, namun tidak mewarnai bakteri.
Untuk

mikroskop

medan

terang,

pewarnaan

negative

biasanya

menggunakan cairan hitam, misalnya nigrosin. Spesimen seperti bakteri dalam

cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur dengan pewarna negatif dan
dibiarkan kering. Ketika diamati dengan mikroskop, bakteri atau sporanya terlihat
bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau pewarna asam
dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena
itu sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta
cina, larutan nigrosin, asam pikrat, dan eosin.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
nigrosin/tinta Cina sewaktu proses pewarnaan. Bakteri gram negatif memiliki
system membran ganda dimana membrane plasmanya diselimuti membrane
lapisan luar permeable. Bakteri gram negatif memiliki dinding sel tebal berupa
peptidoglikan yang terletak diantara membran dalam dan membrane luarnya
Dari hasil pengamatan mikroskop berdasarkan sampel biakan bakteri
streptobasil yang digunakan dengan pewarna tinta cina di dapatkan morfologi
bakteri berbentuk bulat berantai (Streptococcus) . Streptococcus berbentuk bulat
atau oval, memanjang seperti rantai, bersifat gram positif, tidak bergerak, tidak
membentuk spora atau kapsul dan bersifat fakultatif aerob. Diameter bakteri
berukuran 0,7-1,4m. Bakteri ini dapat hidup di air tawar dan air laut dengan
kisaran suhu bagian pertumbuhannya antara 10-45C.Streptococcus adalah sel
sferis, coccus tunggal berbentuk batang atau ovoid dan tersusun seperti rantai
dengan latar belakang hitam. Dan metode pewarnaan yang dilakuan mura, mudah
dan pengerjaannya membutuhkan cukup waktu.
BAB VI
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan, maka dapat ditarik
kesimpulan :
a. Prinsip dasar dari pewarnaan ini yaitu berdasarkan pewarnaan tidak
langsung dengan hanya mewarnai latar belakangnya (kaca objek).
b. Pewarna tinta berfungsi untuk mewarnai preparat namun tidak
mewarnai bakterinya sehingga terlihat bakteri tersebut berwarna
bening terang saat dimikroskop.
c. Berdasarkan hasil pengamatan yang didapat yaitu bentuk morfologi
bakteri C berbentuk Bulat berantai dengan latar belakang hitam. Dan

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1

metode pewarnaan yang digunakan murah, mudah, dan pengerjaannya

membutuhkan cukup waktu.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro,D. 2005. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.
Irawan. 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. Jakarta : UI Press.
Lay, Bibiana.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta:
Rajawali.
Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.
Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta :
Erlangga.

LAPORAN BAKTERIOLOGI 1