KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan
hidayah nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah ini tepat pada
waktu nya. Shalawat beserta salam tak lupa pula kita hadiahkan kepada nabi besar
kita yakni nya nabi besar Muhammad SAW. Yang telah membawa umat nya dari
zaman jahiliyah kepada zaman yang penuh ilmu pengetahuan yang kita rasakan
pada saat sekarang ini.
Makalah ini penulis buat untuk melengkapi tugas mata kuliah
Mikrobiologi dan Parasitologi mengenai Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan
Gram , Nukleus dan Spora
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai
pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan makalah ini. Semoga
menjadi ibadah dan mendapatkan pahala dari Allah SWT. Amin.
Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kesempurnaan.
Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari pembaca,demi
kesempurnaan makalah ini.
Akhir kata penulis berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi
kita semua dan supaya kita selalu berada di bawah lindungan Allah SWT.
Padang, Februari 2014

Penulis

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .....................................................................................

DAFTAR ISI ..................................................................................................

ii

BAB I PENDAHULUAN ..............................................................................

1.1 Latar Belakang ..............................................................................

1.2 Rumusan Masalah..........................................................................
1.3 Tujuan ...........................................................................................

1
1
1

BAB II PEMBAHASAN ...............................................................................

2.1 Identifikasi bakteri dalam Pewarnaan...........................................

2.2 Pewarnaan Gram atau Diferensial .............................................
2.3 Pewarnaan Spora...........................................................................

3
7
16

2.4 Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri...............

19

2.5 Teknik Pewarnaan Gram............................................................

20

2.6 Teknik Pewarnaan Spora ...........................................................

21

2.7 Teknik Pewarnaan Nukleus.........................................................

22

BAB III PENUTUP ........................................................................................

31

3.1 Kesimpulan .................................................................................

31

3.2 Saran ...........................................................................................

31

DAFTAR PUSTAKA......................................................................................

32

LAMPIRAN HASIL DISKUSI........................................................................ 33

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas.
Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain
mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras
dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat
sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan
sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mulamula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau
pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram.Pewarnaan gram
merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan
banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain
sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram
adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika
dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu
pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan
pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau
membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu
Gram negatif dan Gram positif.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana mengidentifikasi bakteri dengan pewarnaan ?
2. Apa itu pewarnaan gram atau pewarnaan diferensial ?
3. Apa itu pewarnaan spora ?
4. Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri ?
5. Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi motivasi ?ss
6. Bagaimana terknik melakukan pewarnaan gram , spora dan nukleus?
1.3 Tujuan
1) Mengetahui cara identifikasi bakteri dengan pewarnaan
2) Mengetahui pewarnaan gram atau pewarnaan diferensial
3) Mengetahui pewarnaan spora
4) Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri
5) Mengetahui teknik terknik melakukan pewarnaan gram , spora, dan
nukleus

BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan

Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur
tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Sel bakteri dapat teramati
dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang
ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri
sulit terlihat.
Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan
menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat
mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan
mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang
berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif.
Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak
banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain
Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll.
Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih jelas dikembangkan teknik
pewarnaan bakteri.
Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan
ion protoplasma sel. Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu :
(1) bersifat Asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam
natrium.
3

(2) bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk
klorida.
Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk
mengendapkan hasil rekasi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat
tersebut dikenal dengan istilah zat Pematek yang akan melekatkan zat warna
pada plasma sel.
Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu :
Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam
zat warna seperti : Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.
Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat
warna. Pengamatan morfologi bakteri hasil pewarnaan dilakukan di
bawah pengamatan mikroskop.

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena
banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu
cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi
ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangkaian pengecatan.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik
secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung
(melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk :
1.

Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.

2.

Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

3.

Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

4.

Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat

fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

(Suriawiria, 1999)
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple
stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special
strain) (Pratiwi, 2008).

1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna
untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat
basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan
karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis
pewarnaan.
Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel
bakteri dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan ini
hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi
terlebih dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri.

Zat warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic
fuchin atau safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer
(utama) yang akan memberi warna mikrioorganisme target. Crystal violet
bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang
bersifat asam (Sutedjo, 1991).

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode bGram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Tujuan dari pewarnaan negatif
adalah untuk mengetahui bentuk mikroba dengan pewarnaan-pewarnaan tidak
langsung. Prinsip pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang
dapat di lakukan untuk membedakan spesies kecil dan cairan optiknya.
Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di gunakan untuk melihat
secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar belakangnya,
sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini
tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk
sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri

praktis tidak mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan

negatif memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas.
Fungsi zat warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna
skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna
utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target (Pelczar,
2007).
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah
metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah
atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

3.Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb.
Contoh pewarnaan khusus : Pewarnaan Endospora Anggota dari genus
Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi
endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel
vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam
tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia.

Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan

endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.

Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan

dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan
pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya,
2010)
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur
Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme
bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan
spiral(Lay, 1994).
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti
pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

Tahap-tahap yang harus dilakukan pada teknik pewarnaan, adalah sebagai

berikut :
1. Menyiapkan kaca objek: menghapus lemak atau minyak untuk
membersihkan kacadengan menggunakan air hangat atau serbuk penggosok,
selanjutnya dengan suatu campuran air dan alkohol (alkohol 95%), kemudian
kaca dikeringkan dan disimpan di atas lap laboratorium sampai siap untuk
digunakan.

2. Pembuatan apusan: menghindari apusan yang tebal dan rapat adalah

penting secara mutlak. Suatu apusan yang baik merupakan selapis tipis. Apusan
dapat dibuat dari kultur kaldu atau medium kultur padat dengan berbagai cara.

3. Dari kultur kaldu, pengambilan satu atau dua loop kultur sel dapat
langsung dipindahkan ke kaca objek dengan loop inokulasi steril dan sebarkan
secara merata kira-kira sebesar uang logam.

4. Dari medium padat: mikroorganisme yang diambil dari medium padat

menghasilkan pertumbuhan yang tebal dan rapat, tidak dapat langsung
dipindahkan ke atas kaca objek. Pemindahan sel dari kultur dilakukan dengan
menggunakan jarum inokulasi steril. Hanya ujung jarum yang menyentuh kultur,
untuk mencegah pemindahan sel terlalu banyak.
Pengenceran dilakukan dengan memutar ujung jarum di atas tetesan air,
sampai kelihatan semitransparan. Sebelum proses selanjutnya , apusan dibiarkan
kering. Jangan ditiup,biarkan kering di udara.
Fiksasi panas: tanpa difiksasi, apusan bakteri akan tercuci selama
memasuki prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dibutuhkan selama protein bakteri
mengalami koagulasi dan melekat di atas permukaan kaca objek. Fiksasi panas
dilakukan dengan melalukan secara cepat apusan kering, sebanyak dua atau tiga
kali di atas lidah api bunsen

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:

a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau
tipis.

b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan

kimia seperti sabun, formalin, fenol.
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.
a.
b.
c.
d.

Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Stuktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu :

1. Struktur dasar (dimiliki hamper semua jenis bakteri )Meliputi : dinding
sel, membrane plasma, sitoplasma, ribasom, DNA, dan granula penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)Meliputi kapsul,
flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola gas dan endospSthaplyococcus
adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni
dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan
ada dua jenis warna staphlycoccus yaitu : sthapylococcus aureus yang berwarna
kuning dan sthapylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karateristik
yang dimiliki sthapylococcus aureus diantaranya hemolytic pada darah segar,
catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh paa suhu erkisar antara 15
sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl padakonsentrasi tinggi hingga 15 persen
dan menghasilkan enzim coagulase. Selin itu, biasanya s. aeureus merupakan
pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paruparu, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing
osteomyelitis dan endocarditis) serta menyebabkan keracunan makanan yaitu
dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik
dengan melepaskan super antigens ke dalam aliran darah (kenneath, 2008)

10

2.2 Perwarnaan Gram ( Pewarnaan

Diferensial)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan
yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.
Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan
berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan
pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air
fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumonia.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi
dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif
(berwarna merah). Perbedaan utama di antara keduanya adalah struktur dan
komposisi dinding selnya.

1. Bakteri Gram Positif

mampu mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram, yaitu

Gentian Violet, sehingga nampak berwarna ungu saat pengamatan
dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian
besar Peptidoglikan, yang mampu mengikat zat warna dan tidak rusak
saat dicuci dengan alcohol.

11

12

memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan
ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari
50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
13

3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.
Tidak peka terhadap streptomisin.
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

2. Bakteri Gram Negatif

memiliki komposisi dinding sel yang sebagian besar tersusun dari lapisan
lipid, sehingga pada saat pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat
warna utama terutama saat dicuci dengan alcohol (lipid rusak saat dicuci
dengan alcohol), akibatnya kelompok bakteri ini memberikan
kenampakan warna merah (warna dari zat warna ke dua : safranin atau
air fuchsin) di akhir kegiatan pewarnaan Gram.

14

dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat didalam.
3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

15

5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal
6.
7.
8.
9.
10.

violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.
Peka terhadap streptomisin.
Toksin yang dibentuk Endotoksin.

Perbedaan secara umum antara bakteri gram negatif dan bakteri gram
positif yaitu : Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan
zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini

16

berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan

struktur dinding sel mereka.

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat
Komposisi dinding sel

Bakteri garam (+)

Kandungan lipid rendah (1-

Bakteri gram negatif(-)

Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap

4%)
Lebih sensitive

Lebih tahan

penisilin
Penghambatan oleh

Lebih dihambat

Kurang dihambat

pewarna basa (VK)

Kebutuhan nutrisi

Kebanyakan spesies relatif

Relatif sederhana

Ketahanaa terhadap

kompleks
Lebih tahan

Kurang tahan

perlakuan fisik

17

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat

mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram
negative sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui
jalanya mekanisme pewarnaan gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1.
2.

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengintensifkan warna utama

3.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic
yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama
4.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

18

Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas

sehingga membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu
crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini
disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada noda spesimen
ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram
Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda
spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa
peluntur warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna
ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan
safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap
berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang
berwarna merah digolongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999).
Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A,
iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.

19

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan gram :

Keasaman
Pelunturan zat warna
Pelunturan zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari
sel yang telah diwarnai. Ini berfungsi untuk mengahsilkan kontras yang baik
pada bayangan mikroskop. Ditinjau dari kekuatan ikatan anatara sel dengan
zat warna, maka dikenal beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan
alcohol, tahan air dan lain-lain. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna
telah diikat kuat oleh sel sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh
asam, begitu juga dengan tahan alcohol dan tahan air masing-masing tidak
dapat dilunturkan oleh alcohol dan air. Ada beberapa macam peluntur zat
warna, antara lain:
a. Peluntur warna bersifat asam yakni HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran
asam-asam tersebut dengan alcohol.
b. Peluntur zat warna bersifat basa yakni KOH, NaOH, sabun dan garamgaram basa.
c. Peluntur zat warna lemah, yaitu alcohol, air minya cengkeh, aseton dan
gliserin
d. Garam-garam logam berat AgNO3, CuSO4 dan lain-lain.
e. Garam-garam logam riangan Na2SO4, MgSO4 dan lain-lain
Umur biakan
Pewarnaan gram memberikan hasil baik bila menggunakan biakan segar
yang berumur 24-48 jm. Bila menggunakan biakan tua maka kemungkinan
besar terjadi penyimpangan hasil pewarnaan gram (Waluyo, 2008).
Perlakuan khusus

Prinsip pewarnaan gram

20

Dinding sel bakteri gram positif terdiri atas lapisan Peptidoglikan yang
tebal menjadikan afinitasnya tinggi terhadap Kristal violet dan iod
membentuk senyawa sukar larut dalam alkohol, sehingga tetap
memegang kuat zat utama ( berwarna ungu ).

Dinding sel bakteri gram negatif mengandung lapisan lemak dan

karbohidrat yang afinitasnya rendah terhadap cat utama dan mudah
luntur atau larut dalam alkohol, selanjutnya akan menerima atau
memegang cat lawan ( berwarna merah ).
Kelebihan dan kekurangan pewarnaan gram

1. Kelebihan
Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan
terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur
dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram
positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis
antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai
makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif
diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan
presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

2. Kekurangan

21

Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak

yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil
mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge
dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil
sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.
Berikut ini adalah penyakit-penyakit yang dapat ditimbulkan bakteri
Gram positif dan negatif:
Gram

Genus
Staphylococcus

Penyakit
impetigo, keracunan makanan,

Streptococcus

bronkitis

Enterococcus

pneumonia/radang paru,

Listeria

meningitis, karies gigi

Bacillus

enteritis

Gram

Clostridium

listeriosis

positif

Mycobacterium

anthrax

Propionibacteriu

tetanus, botulisme

difteri

Mycoplasma

tuberkulosis
jerawat

Gram

Salmonella

pneumonia
Salmonelosis

negatif

Escherichia

gastroenteritis/radang saluran

Shigella

cerna

Neisseria

disentri

22

Bordetella

meningitis, gonorea

Legionella

batuk rejan

Pseudomonas

legionnaires' disease

Vibrio

infeksi luka bakar

Campylobacter

kolera

Helicobacter

gastroenteritis

Haemophilus

tukak lambung

Treponema

bronkitis, pneumonia

Chlamydia

sifilis
pneumonia, uretritis, trakoma

Mekanisme Penyerapan Zat Warna oleh Gram Positif dann Gram

Negatif
Ada kalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna,
kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Ditinjau
dari tujuan pewarnaan sudah barang tentu pewarnaan tersebut merupakan
kegagalan. Tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya hasil basil
TBC dan basil-basil yang berspora. Setelah zat warna yang pertama (ungu)
terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol kemudian ditumpangi dengan zat
warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian
kita cuci dengan air, lalu dengan alcohol maka dua kemungkinan dapat terjadi.
Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang nampak ialah zat warna
asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua, zat

23

warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam
hal ini sediaan bakteri kita katakan gram negatif (Dwidjoseputro,1998).
Menurut Hadioetomo (1988), dinding sel yang lebih tebal pada bakteri
gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi,
menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya
kompleks ungu kristal-iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan sel-sel gram
negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan
lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutan lipid oleh pemucat
yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding
sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan pada sel-sel gram negatif
berlangsung lebih cepat.

2.3

Pewarnaan Spora

24

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar.Spora bakteri mempunyai
fungsi yang sama sepertti kristal amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan
amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu fase di mana kedua
mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar
yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan

25

tubuh dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan
oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu
membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi
sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya,
terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang di
maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar, 2007).
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini
tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih
besar dari pada diameter sel induk. Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam
pembentukanya tidaklah sama bagai semua spesies. Sebagai contoh beberapa
spora adalah sental yang dibentuk ditengah-tengah sel, yang kedua adalah
terminal yang dibentuk diujung, ketiga yaitu subterminal yang dibentuk di dekat
ujung. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium
memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai zat-zat pertukaran zat bertimbuntimbun dan faktor-faktor luar lainya merugikan tetapi pada beberapa spesies
mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi
dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru,
beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuanya untuk membentuk
spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar
menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora
mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya keretakan ini dapat
terjadi pada salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora.
Hal ini merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora

26

pecah di tengah-tengah maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu

tutup pada kedua ujung bakteri (Pelczar, 2001).
Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada
pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan
bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan mengembangkan
lapisan luar spora sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan utama akan
terperangkap didalam spora dengan pencucian zat warna utama yang da pada sel
vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan yang kedua(safranin) sel
vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat warna malachite green merupakan
pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi kedalam endospora (Dwidjoseputro,
2005).

Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan tahan bahan
kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang
tidak mengntungkan bagi bakteri tersebut. Lingkungan yang tidak
memungkinkan atau menguntungkan disebabkan langkanya sumber karbon,
energy dan fosfat. Selain itu bahaya yang bersifat toksik, suhu yang idak sesuai
atau lingkungan yang kering.
Ada dua tipe spora yang terbentuk, yang pertama terbentuk dalam sel,
yang disebut dengan endospora dan spora yang terbentuk diluar sel yang disebut
eksospora. Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan penahan yang baik
terhadap bahan kimia, sehingga spora sulit diwarnai. Spora bakteri dapat
diwarnai dengan cara dipanaskan. Pemanasan ini menyebabkan lapisan luar

27

spora mengembang sehingga zat warna dapat masuk, dapat memakai larutan
hijau malakhit dan lauran safranin (Waluyo, 2008).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pengecatan spora:

1.
2.
3.
4.
5.
6.

2.4

Fiksasi
Smear terlalu tebal
Waktu pengecatan tidak tepat
Konsentrasi reaagen
Umur bakteri
Nutrisi

Faktor- Faktor Yang Mempengaruhi Pewarnaan

Bakteri

1.

Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna

merekatkan sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula
(butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat,
mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan
secara fisik atau dengan bahan kimia.
2.

Peluntur zat warna

Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik

pada bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan
lebih mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai
akan lebih sukar dilunturkan warnanya.
3.

Substrata

28

Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawasenyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein,
karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan.
Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga
macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan sudanofil.

4.

Intensifikasi warna
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan,

yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih
intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi
atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah
mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa
adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.
5.

Zat warna penutup atau zat warna lawan

Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya

dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk

memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mulamula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk
memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama (Sutedjo,
1991).

2.5 Teknik Pewarnaan Gram

Alat :

29

 Object Glass
Cover Glass
Pipet Tetes
Botol Semprot
Bunsen

Bahan :
Apusan Bakteri
Zat Warna Gentian Violet
Iodine
Alcohol
Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin
Aquades
Spiritus

Prosedur :

1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya.

2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan,
biarkan selama 20 detik.
3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik.
4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1
menit.

30

5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak

berwarna (sekitar 10 20 detik).
6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik.
7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20
detik.
8. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik.
9. Keringkan di suhu ruang.
10. Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan
bantuan minyak imersi.

2.6 Teknik Pewarnaan Spora

1. Alat- alat :

Lampu bunsen

Pipel

Objek glass (kaca presparat dan penutup)

Tabung reaksi

Jarum oase

Mikroskop

Kipas angin

Kaca tipis

Spatula

Gunting

31

Spritus

Kertas saring

Pinset

Cover glass

Pensil

Kertas

2. Bahan Bahan :
-

Aquades

Alkohol 95 % + 70 %

Biakan murni satu jenis bakteri

Zat warna Kristal violet

Nigrosin

Larutan logols

Malachite green

Tissue

Crystal violet

Safranin

Methylen

Media Na

Nigrap

Tinta cina

32

Prosedur :

1.
2.
3.
4.
5.

Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%.

Dikeringkan (dilap) dengan tissue.
Difiksasi diatas lampu bunsen.
Ditetesi akuades.
Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca

preparat.
6. Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose.
7. Tutup koloni tersebut dengan menggunakan kertas saring.
8. Teteskan 2-3 tetes malachite green.
9. Difiksasi diatas lampu bunsen.
10. Diamkan selama 1 menit, setelah itu lepas kertas saring.
11. Bilas dengan akuades selama 30 detik.
12. Teteskan safranin selama 30 detik.
13. Keringkan.
14. Amati dengan mikroskop dan catat hasil.

2.7

Teknik Pewarnaan Nukleus

Pegertian Nukleus

Nukleus merupakan organel terbesar dalam sel, terdapat di semua sel

eukariotik, kecuali sel-sel pembuluh floem dewasa dan sel darah merah mamalia
dewasa. Bentuk inti umumnya bulat hingga lonjong dengan garis tengah 10
m (mikro meter) dan panjangnya 20 m. Umumnya tiap sel hanya memiliki
satu inti, tetapi ada juga organisme yang memiliki inti lebih dari satu.
Contohnya, Paramecium yang memiliki dua inti, yaitu mikronukleus dan
makronukleus.

33

Nukleus memiliki peranan yang sangat penting bagi kehidupan sel,

karena berfungsi mengendalikan seluruh kegiatan sel. Hal ini disebabkan karena
inti sel mengandung informasi genetika dalam bentuk DNA (deoxyribonucleic
acid). DNA mampu mereplikasi (membuat tiruan diri) yang diikuti oleh
pembelahan inti. Sehingga, inti duplikasinya mengandung DNA yang sama
seperti induknya.

Nukleus terbungkus oleh selaput inti dan mengandung kromatin, satu

atau dua nukleolus, dan nukleoplasma. Selaput inti terdiri atas dua lapis
membran. Selaput luar berhubungan langsung dengan retikulum endoplasma,
retikulum endoplasma tertutup oleh ribosom dan terlibat dalam sintesis protein.
Pada selaput inti terdapat pori-pori yang memungkinkan pertukaran zat-zat
antara nukleus dan sitoplasma, misalnya keluarnya RNAd (ribonucleic acid
duta), masuknya protein ribosom, nukleotida, dan molekul yang mengatur
kegiatan DNA.

Di dalam inti terdapat nukleoplasma atau getah inti yang berbentuk gel.
Nukleoplasma mengandung berbagai substansi kimia, seperti ion-ion, protein,

34

enzim, dan nukleotid. Kromatin tersusun atas untaian DNA yang terikat pada
protein dasar. Kromatin berarti materi berwarna, karena sifatnya yang mudah
menyerap warna agar bisa dilihat di bawah mikroskop.

Pada proses pembelahan sel, kromatin menyerap zat pewarna secara intensif
sehingga lebih mudah dilihat. Benang kromatin mengerut (memendek)
menyerupai benang terpilin yang disebut kromosom.

Nukleolus memiliki bentuk bulat, terdapat di dalam nukleoplasma yang

berfungsi dalam pembuatan RNA. Selain itu, nukleolus mengandung banyak
DNA yang bertindak sebagai organisator nukleus dan mengandung salinan gengen yang memberi kode RNA ribosom. Nukleolus akan melarut dan tidak
tampak lagi dalam profase (tingkat awal dalam proses pembelahan sel) dan akan
dibuat lagi oleh organisator pada akhir pembelahan sel (telofase).
Nukleus mengandung sebagian besar gen yang mengendalikan sel
eukariota (sebagian lain gen terletak di dalam mitokondria dan kloroplas).
Dengan diameter rata-rata 5 m, organel ini umumnya adalah organel yang
paling mencolok dalam sel eukariota. Kebanyakan sel memiliki satu nukleus,
namun ada pula yang memiliki banyak nukleus, contohnya sel otot rangka, dan
ada pula yang tidak memiliki nukleus, contohnya sel darah merah matang yang
kehilangan nukleusnya saat berkembang.
Selubung nukleus melingkupi nukleus dan memisahkan isinya (yang
disebut nukleoplasma) dari sitoplasma. Selubung ini terdiri dari dua membran

35

yang masing-masing merupakan lapisan ganda lipid dengan protein terkait.

Membran luar dan dalam selubung nukleus dipisahkan oleh ruangan sekitar 20
40 nm. Selubung nukleus memiliki sejumlah pori yang berdiameter sekitar
100 nm dan pada bibir setiap pori, kedua membran selubung nukleus menyatu.
Di dalam nukleus, DNA terorganisasi bersama dengan protein menjadi
kromatin. Sewaktu sel siap untuk membelah, kromatin kusut yang berbentuk
benang akan menggulung, menjadi cukup tebal untuk dibedakan melalui
mikroskop sebagai struktur terpisah yang disebut kromosom.
Struktur yang menonjol di dalam nukleus sel yang sedang tidak membelah ialah
nukleolus, yang merupakan tempat sejumlah komponen ribosom disintesis dan
dirakit. Komponen-komponen ini kemudian dilewatkan melalui pori nukleus ke
sitoplasma, tempat semuanya bergabung menjadi ribosom. Kadang-kadang
terdapat lebih dari satu nukleolus, bergantung pada spesiesnya dan tahap
reproduksi sel tersebut.
Nukleus mengedalikan sintesis protein di dalam sitoplasma dengan cara
mengirim molekul pembawa pesan berupa RNA, yaitu mRNA, yang disintesis
berdasarkan "pesan" gen pada DNA. RNA ini lalu dikeluarkan ke sitoplasma
melalui pori nukleus dan melekat pada ribosom, tempat pesan genetik tersebut
diterjemahkan menjadi urutan asam amino protein yang disintesis.
Fungsi Nukleus adalah sebagai berikut :
1. Mengendalikan seluruh kegiatan sel
2. Mengeluarkan RNA dan subunit ribosom ke sitoplasma

36

3. Mengatur pembelahan sel

4. Membawa informasi genetic Fungsi Nukleus memiliki peran yang sangat vital
dalam kehidupan sebuah sel.
5. Peranan nucleus dalam hal ini adalah untuk mengatur dan mengontrol segala
aktifitas kehidupan sel serta membawainformasi genetik yang diturunkan ke
generasi berikutnya.

Contoh pewarnaan pada nukleus

37

Hematoxylin akan mewarnai nucleus. Ada delapan jenis larutan

pewarnaan haematoxylin, yaitu Dellafied, Erlich, Heidenhains, Harris, Mayer,
Weigert, Carazzi, dan Cole. Masing-masing formula pewarnaan memiliki
kelebihan dan kekurangan masing-masing. Yang paling sering digunakan
adalah haematoxylin Mayer danhaematoxylin Harris.

Komposisi Haematoxylin Mayer

Kristal haematoxylin.... 1 gr
Akuades..... 1000 ml
Sodium iodate 0,2 gr
Ammonium/potassium alum.................. 50 gr
Citric acid...... 1 gr
Chloralhydrate... 50 gr

Cara Pembuatan Hematoxylin Mayer

38

1. Larutkan Ammonium/Potassium alum di dalam aquades.

2. Tambahkan Haematoxylin dan campurkan secara baik.
3. Tambahkan Sodium Iodate, Citric Acid, dan Chloralhydrate.
4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.
5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.

Prosedur Pewarnaan Nukleus dengan Hematoxylin :

- Deparafinasi dengan xylene
- Kelebihan xylene diisap dengan kertas filter melalui tepi gelas benda.
- Celup sebentar dalam alkohol 96%, kemudian 80%, 70%, 50%, 30%, aquadest.
- Masukkan kedalam larutan Hematoxylin dengan waktu tertentu : 3-7 detik.
- Air mengalir : 10 menit. Cuci aquadest sebentar.
- Masukkan sebentar saja berturut-turut mulai dari alkohol 30%, 50%, 70%.
- Kemudian kedalam larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) 1-3 menit.
- Pewarnaan selesai, tetapi jaringan tidak dapat ditutup langsung dengan Canada
balsam, karena Canada balsam dilarutkan dalam xylene, sedangkan jaringan
masih berada dalam media alkohol 70% sehingga jaringan harus dibawa ke
media xylene dulu.
- Dari larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) selanjutnya berturut-turut
masukkan ke alkohol 70%, 80%, 96%, alkohol absolut, masing-masing
sebentar saja.
- Masukkan xylene 10 menit (xylene berfungsi untukl mengantar ke canada
balsam juga berfungsi untuk menjernihkan jaringan yang sudah terpulas).

39

- Jarigan ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan Canada balsam
terlebih dahulu.

Untuk menganalisis struktur jaringan yang telah diiris, preparat harus

diwarnai.Pewarnaan rutin yang sering dikerjakan adalah haematoxylin-eosin
(HE), karena pewarnaan ini dapat menunjukkan sebagian besar struktur
histologi.
Afinitas hematein terhadap nuclei tidak baik, jika tidak menggunakan Mordant.

Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA

Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead.
Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil akhir
pewarnaan

Eosin adalah zat warna Xanthene. Eosin paling cocok dikombinasikan

dengan pewarna haematoxylin. Eosin memiliki nilai kemampuan differensiasi
sendiri untuk membedakan antara sitoplasma dari tiap sel dan serabut jaringan
ikat yang berbeda.
Jenis eosin :

Eosin Y (yellowish), water soluble

Eosin B (Bluish)
Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)

Eosin Y(yellowish) paling banyak digunakan, karena termasuk zat warna

asam sehingga dapat berikatan dengan protein (basa) dan dapat berpenetrasi

40

pada struktur padat dan bersifat metakromatik. Terdapat dalam 2 bentuk ,yaitu :
monomer (merah) dan dimer (orange merah).
Hasil pewarnaannya , yaitu : sitoplasma akan berwarna merah, eritrosit akan
berwarna orange merah, nukleus piknotik akan berwarna ungu, dan nukleolus
akan berwarna merah.

Komposisi Eosin

Eosin-alkohol Stock 1%
Eosin y ws 1 gr
aquades 20 ml
Larutkan dan tambahkan alkohol 95% .. 80 ml

Eosin working solution

Eosin-alkohol stock 1 bagian
Alkohol 80% 3 bagian
Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan Asam Asetat glasial 0,5 ml
untuk
setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.

Cara kerja :

41

1. deparafinisasi preparat yang telah kering ke dalam xylol sebanyak 3x (@

10 menit)
2. Masukkan ke dalam alkohol sebanyak 2x (@5 menit)
3. cuci dengan air mengalir sampai alkohol hilang
4. masukkan ke dalam larutan hematoxylin selama 7 menit
5. cuci dengan air mengalir sampai tidak luntur
6. celupkan dalam HCL 2x celup untuk decolorisasi
7. cuci dengan air
8. rendam dalam air sampai warna air menjadi biru
9. masukkan ke dalam larutan eosin
10. cuci dengan air mengalir
11. cuci dengan alkohol I
12. cuci dengan alkohol II

Gambar Menutup kaca benda dengan cover glass (kiri). Hasil pewarnaan HE
pada kulit tebal (kanan).
Hasil
Nukleus berwarna biru.
Sitoplasma berwarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada

42

komponen tertentu.

Gambar irisan jaringan yang telah diwarnai dan ditutupi dengan cover glass
diletakkan di atas slide tray hingga entellan mengering.

43

BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena
banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu
cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi
ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang
paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri.
Pewarnaan GRAM, bakteri diklasifikasikan ke dalam 2 (dua) kelompok
besar yaitu : Bakteri Gram Positif dan Negatif.
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar.

3.2 Saran
Adapun tujuan pembuatan makalah ini adalah untuk memenuhi tugas
mata kuliah mikrobiologi dan parasitologi . Makalah ini jauh dari kesempurnaan.

44

Untuk itu penulis berharap bagi yang membaca makalah ini bisa memberikan
masukan.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.
Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM.
Malang
Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan

45

46

LAMPIRAN
RANGKUMAN HASIL DISKUSI
Tanggal

: Kamis , 27 Februari 2014

Moderator

: Rahma Puji Astuti

Observer

: Poppy Apriani

Notulen

: Ayu Andira

1. P {Tetry Rahayu Pratama (5)} : Apa perbedaan bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif ?
J {Desi Ratna Sari} :
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
Bakteri garam (+)
Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel
Kandungan lipid rendah (1Kandungan lipid tinggi
4%)
Ketahanan terhadap
Lebih sensitif
Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh
Lebih dihambat
Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi
Kebanyakan spesies relatif
Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap
Lebih tahan
Kurang tahan
perlakuan fisik
2. P {Fitri Yanti (2) } : Apa kekurangan dan kelebihan pewarnaan spora ?
J {Afrilita Putri Yuza} :
o Kekurangannya yaitu : beberapa spesies dapat kehilangan kemampuanya
untuk membentuk spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila
keadaan di luar menguntungkan.
o Kelebihannya yaitu : dapat mengenal dasar-dasar kimiawi pada
pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora
bakteri dan bentuk vegetatif.
3. P {Izzi Wahyuni (2) } : Apa faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan
bakteri?
J { Angelia Yolanda } :

47

a) Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna
merekatkan sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan
granula (butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat selsel lebih kuat, mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas,
fiksasi dapat dilakukan secara fisik atau dengan bahan kimia.
b) Peluntur zat warna
Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik
pada bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai
akan lebih mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang
sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan warnanya.
c) Substrata
Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawasenyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti
protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi
pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka
dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan
sudanofil.
d) Intensifikasi warna
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan,
yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai
lebih intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel.
Mordan dibagi atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa.
Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa.
Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat
warna asam.
e) Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya
dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk
memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat
warna mula-mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan
dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel yang tidak
menyerap zat warna utama (Sutedjo, 1991).
4. P {Riska (4) }: Apa tujuan dari pewarnaan bakteri gram positif dan negatif ?
J {Dian Agusti Tanjung }:
a. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.
b. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
c. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
d. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat
fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

48

5. P {Surya Yuliana (5) } : Apa yang dimaksud dengan larutan Malachite

green ?
J {Dzaiyat Irwan } :
Malachite Green merupakan pewarna triphenylmethane dari group
rasamilin. Bahan ini merupakan bahan yang kerap digunakan untuk
mengobati berbagai penyakit dan parasit dari golongan protozoa .
Fungsi zat warna malachite green merupakan pewarna yang kuat yang
dapat berpenetrasi kedalam endospora

49