LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

“PEWARNAAN BAKTERI”

DOSEN PEMBIMBING :
SAIFUL BAHRI, M.SI

DISUSUN OLEH :
ASHMA CHOIRUNNISA
19330135
KELAS A

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL
2021
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan. Salah satu cara
unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di identifikasi adalah dengan cara
metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecetan atau pewarnaan.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas
dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro,
1998).
Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan praktikum kali ini unutk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pewarnaan sederhana, pengenceran
negative, maupun pengenceran gram serta mengetahui morfologi mikroorganisme
(Sutedjo, 1991).

1.2 Tujuan Percobaan

1. Untuk pengamatan morfologi mikroskopik (ukuran, bentuk, struktur luar dan struktur
dalam) bakteri , karena sel bakteri bersifat tembus cahaya (transparan), sel bakteri
tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya sehingga diperlukan pewarnaan.
2. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga mikroorganisme terlihat
kontras dengan sekelilingnya.
3. Mempelajari cara membuat olesan bakteri yang dibutuhkan dalam pewarnaan bakteri.
4. Mempelajari prosedur pewarnaan sederhana dan gram (differensial) serta mengetahui
reaksi kimia yang terjadi dalam proses pewarnaan bakteri.
1.3 Prinsip Percobaan
Adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik
pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka
dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Dasar Teori

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pewarnaan.
Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop biasa tanpa dengan
cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergabtung, menggunakan kondensor
medan gelap dan lain-lain. Tetapi pengamatan dari pearnaan ini lebih sukar dan tidak
dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba
lainnya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri, sehingga
sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwijoseputro, 2005).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam
bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang
khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme
dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan
tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-
sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial
 (Pelczar & Chan, 2009).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan zat warna yang tunggal
bertujuan untuk mengindentifikasi morfologi sel bakteri. Pada pewarnaan ini zat warna
yang kami gunakan adalah gentiana violet. Biasanya bakteri maupun sekitarnya akan
mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna sederhana
yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya dengan menambahkan pada
olesan yang telah difiksasi salah satu diantaranya zat warna berikut : Lembayung gentian,
lembayung safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin bara yang lainnya.
(Pelczar & Chan, 2009).

a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan
tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam
pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin. (Pelczar & Chan, 2009).
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan
ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina (Pelczar & Chan,2009).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat
yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang
cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang
banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan
fukhsin-karbol (5 detik) (Pelczar & Chan, 2009).
2. Pewarnaan differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan Gram.
 Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini di beri nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiela pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini dibagi
menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri
garam positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan
kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi
zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarna air fucshin atau safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam struktur
kimiawi dinding selnya (Pelczar dan Chan, 2009).

 Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.
c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. (Pelczar dan Chan, 2009).

 Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu :

a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. (Pelczar dan Chan, 2009).
 Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
 a. Zat warna utama (violet kristal)
b. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama
c. Pencuci/peluntur zat warna (alcohol/aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
d. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol. (Pelczar dan
Chan, 2009).

Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah
setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi
dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting;
dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram
positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif.
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah
pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan
dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi
digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri
 BAB III

METODELOGI PRAKTIKUM

3.1 Alat dan Bahan

Alat :
1. Mikroskop 8. Beaker gelas
2. Jarum ose 9. Gelas piala
3. Cawan petri 10. Cover glass
4. Bunsen 11. Kertas saring
5. Kapas 12. Pinset
6. Pipet tetes 13. Objek glass
7. Botol 14. Gunting

Bahan :

1. Alkohol 95%
2. Aquades
3. Kristal violet
4. Nigrosin
5. Tinta cina
6. Safranin
7. Malachite green
8. Alkohol 70%
9. Karbol Fuchion

3.2 Prosedur Kerja

 Pewarnaan Sederhana
1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas
Bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit
aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas
preparat glass
 4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5. Diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes
6. Dikeringkan dan dianginkan selama 1 menit
7. Dicuci dengan air mengalir
8. Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9. Diamati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri

 Pewarnaan gram
1. Buat preparat ulas dengan cara member setetes aquades yang telah steril ke atas
kaca preparat.
2. Ambil biakan bakteri dari biakan yang telah dibuat sebanyak 1 ose, lalu oleskan
bakteri di aquades secara merata dan setipis mungkin. Saat mengambil biakan
harus dilakukan di dekat bunsen yang menyala.
3. Jepit kaca preparat dengan penjepit tabung reaksi, lalu fiksasi di atas api sampai
preparat kering.
4. Beri larutan Kristal violet selama 1 menit.
5. Bilas dengan aquades selama 5 detik
6. tambahkan dengan iodin, selama 1 menit.
7. Pencucian menggunakan alkohol selama 45 menit
8. Cuci dengan aquades selama 5 detik.
9. Beri larutan safranin selama 45 detik.
10. Cuci dengan aquades selama 5 detik, kemidian keringkan dengan kertas saring.
11. Perhatikan warna akhir yang terbentuk. Organisme gram positif akan berwarna
ungu atau biru, sedangkan organisme gram negatif akan berwarna merah muda
atau merah.
12. Amati di bawah mikroskop dengan penambahan minyak imersi.

 Pewarnaan endospora
1. Bersihkan objek glass menggunakan alkohol dan keringkan
2. Ambil satu tetes suspensi mikroba, ratakan setipis mungkin
3. Kering anginkan, kemudian fiksasi diatas api Bunsen
4. Teteskan malachite green (3 tetes) biarkan selama 2 menit, kemudian fiksasi
hingga menguap
5. Cuci dengan air mengalir, kemudian kering anginkan
 6. Tambahkan safranin, biarkan selama 1 menit. Cuci dengan air mengalir dan kering
anginkan
7. Periksa dengan mikroskop, gambarkan letak spora bakteri yang terlihat

 Pewarnaan negatif
1. Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%
2. Dikeringkan (dilap) dengan tissue
3. Difiksasi di atas lampu bunsen
4. Ditetesi aquades
5. Difiksasi sampai tetesan aquades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat
6. Diambil larutan Nigrosin (tinta cina)
7. Keringkan (anginkan) kaca preparat
8. Amati dibawah mikroskop dan catat hasilnya
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL
1. TABEL HASIL PEWARNAAN SEDERHANA
NAMA BAKTERI GAMBAR KETERANGAN
Micrococcus luteus  Bentuk Sel : Coccus / bulat
 Susunan Sel : Diplococcus
 Warna sel : Ungu
 Reaksi Pewarnaan Gram : Ungu
 Struktur Bakteri : Dinding sel tebal

PEMBAHASAN:
 Tujuan Pewarnaan Sederhana adalah untuk mewarnai seluruh permukaan sel
sehingga bentuk sel dan struktur dasar sel dapat terlihat.
 Zat Warna Yang Dapat Digunakan adalah Chrystal Violet, Methylen Blue, dan
Safranin
 Hasil Pengamatan Morfologi
Micrococcus luteus adalah bakteri gram positif yang ditandai dengan
hasil pewarnaan bakterinya menghasilkan warna ungu atau biru, serta sel nya
mempunyai bentuk coccus atau bulat dengan bentuk susunan selnya
diplococcus dan struktur bakterinya mempunyai dinding sel yang tebal.

2. TABEL HASIL PEWARNAAN GRAM

NAMA BAKTERI GAMBAR KETERANGAN
Staphylococcus aureus  Bentuk Sel : Coccus / bulat
 Susunan Sel : Tersusun seperti
untaian buahanggur(
Staphylococcus )
 Warna Sel : Kuning
 Reaksi Pewarnaan Gram ( + ) :
Ungu
 Struktur Bakteri : Dinding sel tebal
 Escherichia coli  Bentuk Sel : Coccobacil / batang
pendek
 Susunan Sel : Monobasil
 Reaksi Pewarnaan Gram ( - ):
Merah
 Struktur Bakteri : Dinding sel
tipis

PEMBAHASAN:
1. Staphylococcus aureus:
 Tujuan Pewarnaan Gram adalah agar dapat membedakan antara bakteri
gram positif dengan bakteri gram negatif yang berdasarkan komposisi
dinding selnya.
 Zat Warna Yang Digunakan adalah Chrystal Violet dan Safranin
 Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri
Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif yang ditandai
dengan hasil pewarnaan bakterinya yang menghasilkan warna ungu atau
biru, serta sel bakterinya memiliki bentuk coccus (bulat) dengan bentuk
susunan selnya streptococcus yaitu seperti buah anggur dan struktur
bakterinya mempunyai dinding sel yang tebal.
2. Escherichia coli :
 Tujuan Pewarnaan Gram adalah supaya dapat membedakan antara bakteri
gram positif dengan bakteri gram negatif yang berdasarkan komposisi
dinding selnya.
 Zat Warna Yang Digunakan : Chrystal Violet dan Safranin
 Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri :
Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif yang ditandai
dengan hasil pewarnaan bakterinya yang menghasilkan warna merah,
serta sel bakterinya memiliki bentuk basil atau batang dengan bentuk
susunan selnya monobasil dan struktur bakterinya mempunyai dinding
sel yang tipis.
3. TABEL HASIL PEWARNAAN ENDOSPORA
NAMA BAKTERI
Bacillus subtilis
GAMBAR KETERANGAN
 Bentuk Sel : Bacil / batang
 Susunan Sel : Streptobacilus
 Reaksi Pewarnaan Gram :
Endospora : Hijau
Sel Vegetatif : Merah
 Struktur Bakteri : Dinding sel
peptidoglikan

PEMBAHASAN:
 Tujuan Pewarnaan Endospora adalah untuk mewarnai bagian spesifik dari sel
bakteri seperti endosporenya serta dapat mengetahui bentuk dan susunan
bakterinya
 Zat Warna Yang Digunakan adalah malachite green dan safranin
 Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram negatif dengan hasil pewarnaan
sel vegetatif nya bewarna merah, dan sel endospore nya bewarna hijau serta sel
bakterinya memiliki bentuk basil atau batang dengan bentuk susunan selnya
streptobasil dan struktur bakterinya mempunyai dinding sel peptidoglikan
4. TABEL HASIL PEWARNAAN NEGATIF
NAMA BAKTERI GAMBAR KETERANGAN
Bacillus subtilis  Bentuk Sel : Bacil batang
 Susunan Sel : Streptobacillus
 Warna Sel : Coklat
 Reaksi Pewarnaan Gram :
Latar : Hitam Sel :
Transparan
 Struktur Bakteri : Dinding sel
peptidoglikan
PEMBAHASAN:
 Tujuan Pewarnaan Negatif adalah agar dapat mengetahui bentuk bakteri serta
susunannya
 Zat Warna Yang Digunakan adalah Nigrosine
 Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri
 Bacillus subtilis merupakan bakteri gram negatif dengan pewarnaan latar
belakangnya yang gelap atau hitam dan sel bakterinya transparan atau tidak
bewarna. Bakterinya memiliki bentuk basil atau batang dengan bentuk susunan
selnya streptobasil dan struktur bakterinya mempunyai dinding sel peptidoglikan.
 BAB V
PENUTUP

Kesimpulan

1. Pada praktikum kali ini digunakan 4 macam metode pewarnaan yaitu : pewarnaan
sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan endospora (pewarnaan khusus), dan pewarnaan
negatif.
2. Bakteri terbagi menjadi 2, yaitu :
a. Bakteri gram positif yaitu bakteri yang mengikat zat warna utama dengan kuat sehingga
tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak dapat diwarnai lagi oleh zat warna lawan.
(pada pengamatan kali ini bakteri berwarna violet).
b. Bakteri gram negatif yaitu bakteri yang bersifat kebalikan dari gram positif (yang pada
kali ini bakteri tampak berwarna merah).
3. Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan kali ini adalah : kristal violet, safranin,
Iodin, malachite green dan, nigrosine.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Dwidjoseputro, D.1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan

2. Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga
3. Hamid, H. 2010. Morfologi dan Anatomi Mikroorganisme. Malang : UMM press
4. Lay, Bibiana.W.1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali
5. Pelczar., Michael J. dan E. C. S. Chan, 2009. Dasar-Dasar Mikroorganisme. Jakarta :
Universitas Indonesia Press