PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN

MORFOLOGI BAKTERI
DIPOSTING OLEH INA SHOLIHAHDI 07.171 KOMENTAR

I. Tujuan
Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan
bakteri ke dalam kelompok bakteri gram positif atau bakteri gram negatif serta
menentukan morfologinya.
II. Pendahuluan
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri adalah domain yang terdiri dari
makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri memiliki
beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan spiral, serta dapat hidup soliter
maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi dari air, tanah, udara, hingga
dalam tubuh hewan. Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna
dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka
hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila
diamati dengan mikroskop (Dwidjoseputro, 2005).
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya
adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik
pewarnaan atau pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk
kepentingan identifikasi bakteri. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang
diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan gram)
dapat digunakan untuk identifikasi awal. Dengan metode pengecatan gram, bakteri
dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri
tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram
tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel. Dalam
proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat
pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat
pewarna tandingannya berupa safranin.
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil ungu
atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan
berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan
berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Karmana,
2008).Berdasarkan hal tersebut maka dilakukanlah agar praktikan dapat memahami
dan melakukan pewarnaan gram terhadap suatu jenis bakteri; mengidentifikasi suatu
jenis bakteri gram positif atau gram negatif; dan mengamati bentuk bakteri.
III. Tinjauan Pustaka
A. Pewarnaan Gram
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang
yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
 sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 m. (Pelczar dan Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan
struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik
dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya. (Pelczar & Chan,2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena
reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang
digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. (Pelczar & Chan, 2007).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion
dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarna.(Volk dan Wheeler, 1993)
Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan zat warna yang tunggal
bertujuan untuk mengindentifikasi morfologi sel bakteri. Pada pewarnaan ini zat
warna yang kami gunakan adalah gentiana violet.Biasanya bakteri maupuin sekitarnya
akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna
sederhana yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya dengan
menambahkan pada olesan yang telah difiksasi salah satu diantaranya zat warna
berikut : Lembayung gentian, lembayung safranin, biru metilen, furchin bara dan zat
warna anilin bara yang lainnya. (Pelczar & Chan, 2007)
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah metilen biru dan air furksin. (Pelczar & Chan, 2007)
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta
cina. (Pelczar & Chan,2007)
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat
yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara
yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna
yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan
fukhsin-karbol (5 detik).(Pelczar & Chan, 2007)
2. Pewarnaan differensial
 Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan
gram. Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang
paling penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini di beri
nama berdasarkan penemunya,ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-
1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan
metode ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram
negatif. Bakteri garam positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan
karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri
gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol
dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau
safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya(Pelczar dan Chan, 2007).
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.
c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
(Pelczar dan Chan, 2007)
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
(Pelczar dan Chan, 2007)
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
a. Zat warna utama (violet kristal)
b. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
c. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
d. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol. (Pelczar dan Chan,
2007)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif
ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan
komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat
merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih
tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram
 negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen
pengecatan menunjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang
menyebabkan poisitas atau permeabilitas dinding sel meningkat. Dengan demikian,
kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif
terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan
permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif
kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih
sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram
negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian
violet dan lugol. Selanjutnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dengan lisozim
untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel
tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi,
sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur
dinding sel bakteri Gram positif itu yang menjadi tempat pertahannya zat pewarna
pertama yaitu karbol gentian violet. (Karmana, 2008)
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel
bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka
poripori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri
menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi
selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan poripori sehingga menghasilkan
kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan
lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya
menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 12 lapisan
peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan
Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, alkohol, Ammonium oksalat,
Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C (Aseton,
Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Pelczar & Chan, 2007).
Perbandingan Karakteristik Gram positif dan Gram negatif
1. Dinding sel
a. Gram positif : Homogen dan tebal (20-80 nm) serta sebagian besar tersusun dari
peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.
b. Gram negatif : Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dam dan luar, serta adanya
membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan lipopolisakarida
2. Bentuk sel
a. Gram positif : Bulat, batang atau filamen
b. Gram negatif : Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand koma, heliks atau
filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul
3. Reproduksi
a. Gram positif : Pembelahan biner
b. Gram negatif : Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan
4. Metabolisme
a. Gram positif : kemoorganoheterotrof
b. Gram negatif : Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof
5. Motilitas
a. Gram positif : Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus
(petritrichous)
b. Gram negatif : Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus
(lophtrichous), petritrikus (petritrichous).
6. Anggota tubuh (apendase)
a. Gram positif : Biasanya tidak memiliki apendase
b. Gram negatif : Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
7. Endospora
a. Gram positif : Beberapa grup dapat membentuk endspora
b. Gram negatif : Tidak dapat membentuk endospora
(Tracy, 2005)
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram
negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid
tinggi
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik
(Tracy, 2005)
3. Pewarnaan tahan asam
Pewarnaan ini menggunakan pewarna utama karbol fuksin. Yang memungkinkan
bakteri tahan asam terlihat berwarna merah, sementara jenis lain akan tampak sesuai
pewarna pembanding. Pewarnaan Ziehl-Neelsen menggunakan 3 jenis larutan, yaitu
ZN A, ZN B, dan ZN C. Larutan ZN A merupakan cat utama yang berupa
karbolfuksin, memberikan warna merah kepada sel bakteri. Larutan ZN B adalah
peluntur yang berupa etanol, yang melunturkan warna merah pada bakteri tidak tahan
asam, sementara warna merah pada bakteri tahan asam tidak luntur. Larutan ZN B
merupakan pewarna pembanding berupa methylen blue, sehingga bakteri tidak tahan
asam yang tadi warnanya luntur memiliki kekontrasan dengan bakteri tahan asam.
Hasil akhirnya adalah bakteri tahan asam tampak berwarna merah, sementara bakteri
tidak tahan asam berwarna biru. (Pelczar & Chan, 2007).
4. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan
spora, pewarnaan kapsul dan pewarnaan nucleoid
a. Pewarnaan Spora
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti
kristal amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk Kristal
merupakan suatu fase di mana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk
melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya
terdapat pada bakteri merupakan tubuh dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan
sangat resisten. Dihasilkan oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina.
Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama
banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam
 pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang
di maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar dan Chan, 2007).
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini tergantung oleh
spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih besar dari pada
diameter sel induk. Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam pembentukanya
tidaklah sama bagai semua spesies. Sebagai contoh beberapa spora adalah sental yang
dibentuk ditengah-tengah sel, yang kedua adalah terminal yang dibentuk diujung,
ketiga yaitu subterminal yang dibentuk di dekat ujung. Pada umumnya sporulasi itu
mudah terjadi jika keadaan medium memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai zat-
zat pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor luar lainya merugikan tetapi
pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor
luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium
yang baru, beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuanya untuk
membentuk spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar
menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora
mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya keretakan ini dapat terjadi
pada salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora. Hal ini
merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di tengah-
tengah maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung
bakteri (Pelczar dan Chan, 2007).
b. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.(Tracy, 2005).
c. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika
pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna
pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. (Pelczar dan Chan, 2007).
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Hamid,
2010).
5. Pewarnaan negatif
Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar belakang sel dengan zat warna
asam, sehingga sel sel tersebut secar kontras tidak berwarna. Yang biasanya dipakai
adalah zat warna hitam nigrosin. Metode ini digunakan untuk sel sel dan struktur
struktur yang sukar diwarnai secara langsung.(Hamid, 2010).
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai berikut:
1. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan sel
bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran) protein
menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah terjadinya
otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik atau dengan bahan
kimia.
2. Peluntur zat warna
Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada
bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah
 pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar
dilunturkan warnanya.
3. Substrata
Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa
tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat,
lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna
yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil,
basodill dan sudanofil.
4. Intensifikasi warna
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat
kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena zat
warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu
mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan
zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan
anion zat warna asam.
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat
warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan warna pada
sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna penutup
diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-
sel yang tidak menyerap zat warna utama.
(Pelczar & Chan, 2007).
B. Morfologi Bakteri
Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk klas Schizomycetes,
berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil
kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. Cara hidup bakteri ada yang dapat hidup
bebas, parasitik, saprofitik, patogen pada manusia, hewan dan tumbuhan. Habitatnya
tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai 10 km diatas bumi), di
dalam lumpur, dan di laut. Bakteri mempunyai bentuk dasar bulat, batang, dan
lengkung. Umumnya bakteri berukuran 0,5-10 m. (Volk dan Wheeler, 1993)
a. Bakteri bentuk bulat
Bakteri berbentuk bulat dikenal sebagai basil. Kata basil berasal dari bacillusyang
berarti batang. Bentuk basil dapat pula dibedakan atas:
1. Basil tunggal yaitu bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal,
misalnya Salmonella typhi, penyebab penyakit tipus.
2. Diplobasil yaitu bakteri berbentuk batang yag bergandengan dua-dua.
3. Streptobasil yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang
membentuk rantai misalnya Bacillus anthracis penyebab penyakit antraks.
b. Bakteri bentuk bola
Bakteri berbentuk bola dikenal sebagai coccus, bakteri ini juga dapat dibedakan atas:
1. Monokokus, yaitu bakteri berbentuk bola tunggal, misalnya Neisseria
gonorrhoeae, penyebab penyakit kencing nanah.
2. Diplokokus, yaitu bakeri berbentuk bola yang bergandengan dua-dua,
misalnya Diplococcus pneumonia penyebab penyakit pneumonia atau radang paru-
paru.
3. Sarkina, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat-empat sehngga
bentuknya mirip kubus.
 4. Streptokokus, yaitu bakteri bentuk bola yang berkelompok memanjang membentuk
rantai.
5. Stafilokokus, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkoloni membentuk sekelompok sel
tidak teratur sehingga bentuknya mirip dompolan buah anggur.
c. Bakteri bentuk spiral
adalah bakteri yang bengkok atau tidak lurus atau berbentuk silinder. Bakteri yang
berbentuk spiral itu tidak banyak terdapat. Spiral terbagi menjadi tiga bentuk
diantaranya :
1. Vibrio atau bakteri koma
Batang melengkung seperti koma dan kadang membelit seperti huruf S. Mempunyai
spiral yang pendek.
2. Spiril
Bentuknya seperti spiral atau seperti lilitan. Individu-individu sel yang tidak saling
melekat.
3. Spirocheta
Bentuknya seperti spiral tetapi pergerakannya sangat aktif yang dimungkinkan karena
adanya flagela yang membelit diketahui bentuk aslinya (Hamid, 2010).

Ada tiga mcam bentuk spiral:

1. Spiral, yaitu golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral misalnyaSpirillum.
2. Vibrio, ini dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna, misalnya Vibrio
cholera penyebab penyakit kolera.
3. Spiroseta yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang besifat lentur. Pada saat
bergerak, tubuhnya dapa memanjang dan mengerut.
(Istamar, 2004)
Anatomi bakteri
Bakteri tersusun atas dinding sel dan isi sel. Disebelah luar dinding sel terdapat
selubung atau kapsul. Di dalam sel bakteri tidak terdapat membrane dalam
(endomembran) dan organel bermembran seperti kloroplas dan mitkondria. Struktur
tubuh bakteri dari lapisan luar hingga bagian dalam sel yaitu flagela, dinding sel,
membrane sel, mesosom, lembaran fotosintetik, sitoplasma, DNA, plasmid, ribosom,
dan endospora. (Istamar, 2004)
a. Flagela
Flagela terdapat salah satu ujung, pada kedua ujung atau pada perukaan sel.
Fungsinya untuk bergerak. Berdasar letak dan jumlahnya, tipe flagella dapat
dibedakan menjadi montrik, amfitrik, lofotrik, dan peritrik.Flagela terbuat dari
protein yang disebut flagelin. Flagella berbetuk seperti pembuka sumbat botol.
Fungsinya adalah untuk bergerak. Flagella berputar seperti baling-baling untuk
menggerakkan bakteri. Flagela melekat pada membrane sel. (Istamar, 2004)
b. Dinding sel
Dinding sel tersusun atas peptidoglikan yakni polisakarida yang berikatan dengan
protein. Dengan adanya dinding sel ini, tubuh bakteri memiliki bentuk yang tetap.
Fungsi dinding sel adalah untuk melindungi sel. (Istamar, 2004)
Di sebelah luar dinding sel terdapat kapsul. Tidak semua sel bakteri memiliki
kapsul. Hanya bakteri patogen yang berkapsul. Kapsul berfungsi untuk
mempertahankan diri dari antibodi yang dihasilkan selinang. Kapsul juga berfungdi
 untuk melindungi sel dari kekeringan. Kapsul bakteri tersusun atas persenyawaan
antara protein dan glikogen yaitu glikoprotein. (Istamar, 2004)
c. Membrane sel
Membrane sel tersusun atas molekul lemak dan protein, seperti halnya membran sel
organisme yang lain. Membrane sel bersifat semipermiable dan berfungsi mengatur
keluar masuknya zat keluar atau ke dalam sel. (Istamar, 2004)
d. Mesosom
Pada tempat tertentu terjadi penonjolan membran sel kearah dalam atau ke
sitoplasma. Tonjolan membrane ini berguna untuk menyediakan energi atau pabrik
energi bakteri. Organ sel (organel) ini disebut mesosom. Selain itu mesosom berfungsi
juga sebagai pusat pembentukan dinding sel baru diantara kedua sel anak pada proses
pembelahan. (Istamar, 2004)
e. Lembar fotosintetik
Khusus pada bakteri berfotosintesis, terdapat pelipatan membrane sel kearah
sitoplasma. Membrn yang berlipat-lipat tersebut berisi klorofil,dikenal sebagai lembar
fotosintetik (tilakoid). Lembar fotosintetik berfungsi untuk fotosintesis contohnya pada
bakteri ungu. Bakteri lain yang tidak berfotosintesis tidak memiliki lipatan demikian.
(Istamar, 2004)
f. Sitoplasma
Sitoplasma adalah cairan yang berada di dalam sel (cytos = sel, plasma= cairan).
Sitoplasma tersusun atas koloid yang mengandung berbagai molekul organik seperti
karbohidrat, lemak, protein, mineral, ribosom, DNA, dan enzim-enzim. Sitoplasma
merupakan tempat berlangsungya reaksi-reaksi metabolism. (Istamar, 2004)
g. DNA
Asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid, disingkat DNA) atau asam inti,
merupakan materi genetic bakteri yang terdapat di dalam sitoplasma. Bentuk DNA
bakteri seperti kalung yang tidak berujung pangkal. Bentuk demikian dikenal sebagai
DNA sirkuler. DNA tersusun atas dua utas polinukleotida berpilin. DNA merupakan
zat pengontrol sintesis protein bakteri, dan merupakanzat pembawa sifat atau gen.
DNA ini dikenal pula sebagai kromosom bakteri. DNA bakteri tidak tersebar di dalam
sitoplasma, melainkan terdapat pada daerah tertentu yang disebut daerah inti. Materi
genetik inilah yang dikenal sebagai inti bakteri. (Istamar, 2004)
h. Plasmid
Selain memiliki DNA kromosom, bakteri juga memiliki DNA nonkromosom. DNA
nokromosom bentuknya juga sirkuler dan terletak di luar DNA kromosom. DNA
nonkromosom sirkuler ini dikenal sebagai plasmid. Ukuran plasmid sekitar 1/1000 kali
DNA kromosom. Plasmid mengandung gen-gen tertentu misalnya gen kebal antibiotik,
gen patogen. Seperti halnya DNA yang lain, plasmid mampu melakukan replikasi dan
membentuk kopi dirinya dalam jumlah banyak. Dalam sel bakteri dapat terbentuk 10-
20 plasmid. (Istamar, 2004)
i. Ribosom
Ribosom merupakan organel yang berfungsi dalam sintesis protein atau sebagai
pabrik protein. Bentuknya berupa butir-butir kecil dan tidak diselubungi membran.
Ribosom tersusun atas protein dan RNA. Di dalam sel bakteri Escherichia
coli terkandung 15.000 ribosom, atau kira-kira masa sel bakteri tersebut. Ini
menunjukkan bahwa ribosom memiliki fungsi yang penting bagi bakteri. (Istamar,
2004)
 j. Endospora
Bakteri ada yang dapat membentuk endospora, pembentukan endospora merupakan
cara bakteri mengatasi kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan. Endospora
tahan terhadap panas sehingga tidak mati oleh proses memasak biasa. Spora mati di
atas suhu 120 C. jika kondisi telah membaik, endospora dapat tumbuh menjadi bakteri
seperti sedia kala.( Istamar, 2004)
IV. Metode
4.1 Alat
a. Obyek glass
b. Cover glass
c. Mikroskop Cahaya Listrik
d. Jarum inokulasi
e. Bunsen
f. Rak tabung
g. Tabung reaksi
h. Beaker glass
i. Pipet tetes
j. Hair dryer
4.2 Bahan
a. Biakan kuman Staptyloeoccus aereus
b. Gram A : Carbol gentian violet
c. Gram B : Iodium
d. Gram C : Alkohol 95%
e. Gram D : Safranin
f. Air
g. Kapas
h. Minyak imersi
4.3 Cara kerja
a. Membersihkan tangan dan meja dengan alkohol.
b. Diambil obyek glass dan fiksasi dengan melidah apikan di atas Bunsen sebanyak 2 3
kali secara cepat.
c. Diambil antara 1 2 ose biakan kuman Staptyloeoccus aereus dan diletakkan di atas
obyek glass.
d. Diratakan biakan murni Staptyloeoccus aereus dengan jarum ose.
e. Difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2 3
kali dengan cepat.
f. Dituangkan pewarna Carbol gentian violet, biarkan 1 menit.
g. Dibuang sisa Carbol gentian violet.
h. Dicuci preparat dengan air mengalir.
i. Dikering preparat dengan menggunakan hair dryer.
j. Dituangkan pewarna Iodium, biarkan selama 2 menit.
k. Dibuang sisa Iodium.
l. Dicuci preparat dengan air mengalir.
m. Dikeringkan preparat menggunakan hair dryer.
n. Dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan sampai warna
ungu hilang.
o. Dibilas dengan air mengalir.
 p. Dituangkan pewarna Safranin sebagai warna penutup atau pembanding biarkan
selama 30 detik.
q. Dibuang kelebihan Safranin.
r. Dicuci preparat dengan air mengalir.
s. Dikeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap.
t. Ditambahkan minyak imersi pada preparat.
u. Mengamati preparat di bawah mikroskop dengan pembesaran lemah kemudian
pembesaran kuat (100X).
v. Diamati jenis dan bentuk morfologi bakteri.
V. Hasil Praktikum
No Nama Gambar Keterangan
1 Staphylococcus - Jenis bakteri gram positif
aureus - Berwarna merah muda
dan ada yang sedikit biru
tua
- Bentuk : bulat
- morfologinya stafilokokus

VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan perwarnaan gram pada bakteri. Pewarnaan
gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri
apakah gram positif atau gram negatif. Pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu
pewarna dan memiliki reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri sehingga dapat
digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan gram ini mampu membedakan dua
kelompok besar bakteri, yaitu gram positif dan gram negatif.
Pada pewarnaan Gram, bakteri yang digunakan yaitu Staphyloecoccus aureus. Umur
bakteri pada pewarnaan gram harus berumur 24 jam atau 1 hari.
Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan mikroskop cahaya
listrik bahwa Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna
merah muda dan ada yang sedikit biru tua , morfologinya stafilokokus, dan berbentuk
bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet)
dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi
oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna
ungu.Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat
Kristal violet lebih kuat. Namun selama praktek, hasil warna bakteri yang kami amati
berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua. Perbedaan warna ini disebabkan
oleh kesalahan pada proses pewarnaan dalam tahap pengeringan preparat yang terlalu
panas sehingga menghasilkan warna merah muda dan bakteri yang seharusnya gram
positif berubah menjadi bakteri gram negatif.
Staphylococcus termasuk ke dalam bakteri gram positif. Karena menggunakan
teknik pewarnaan gram, bakteri ini memiliki peptidoglikan yang tebal, sehingga dapat
mengikat cat gram dengan kuat,sehingga disebut gram positif. karena dia termasuk
dalam kelompok bakteri gram positif, maka warna dari Staphylococcus adalah ungu
dengan warna dasar merah. Hal tersebut dikarenakan kandungan lipid dari bakteri
gram positif lebih rendah dan banyak mengandung peptidoglikan.Karena kandungan
lipidnya yang lebih rendah ,dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi
selama perlakuan dengan etanol sehingga bakteri gram positif mempertahankan zat
pewarna ungu Kristalnya.
Langkah langkah yang dilakukan selama pewarnaan gram adalah proses sterilisasi
sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri dalam praktek.
Alkohol yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun
sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk
menyeterilkan atau membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar
mendapatkan hasil yang akurat.
Sample biakan bakteri Staptyloeoccus aereus diambil sekitar 1 2 ose, diletakkan di
atas obyek glass serta diratakan dengan jarum ose. Kemudian difiksasi untuk
menguapkan air sehingga hanya akan didapatkan bakteri saja. Proses fiksasi juga
bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada obyek glass sehingga olesan
bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian.
Proses fiksasi dengan pemanasan biasanya di atas bunsen pada pewarnaan gram dapat
menyebabkan bakteri tersuspensi mati atau tidak produktif apabila suhu terlalu tinggi,
walaupun dapat melekatkan bakteri pada kaca preparat. Setelah itu biakan bakteri
dituangi pewarna carbol gentian vioet yang berfungsi memberikan pewarnaan pada
bakteri tersebut. Bakteri akan berwarna ungu. Penuangan carbol gentian vioet harus
merata pada seluruh area biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat
terwarnai dengan sempurna. Bakteri yang telah diwarnai dibiarkan selama 1 menit
agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin kuat. Kemudian sisa carbol
gentian vioet dan dicuci dengan air mengalir dan dikering preparat dengan hair drier.
Langkah selanjutnya, penuangan iodium kemudian didiamkan selama 2 menit.
Iodium merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi mengfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna
utama. Pemberian iodium bertujuan untuk memperkuat pengikatan warna oleh
bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme
gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodium yang
diteteskan didiamkan selama 2 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri
menjadi semakin lebih kuat. Setelah itu, kaca preparat dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang dan dikeringkan dengan menggunakan hair drier.
Langkah selanjutnya adalah meneteskan alkohol 95 % dengan perlahan sampai
warna ungu hilang. Penetesan alkohol 95 % pada biakan bakteri untuk melakukan
penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek Kristal
ungu dan iodium. Pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena
mengandung peptidoglikan. Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada
dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan
membrane menurun sehingga komplek Kristal ungu dan iodium tidak dapat keluar
dari sel dan tetap berwarna ungu. Setelah itu dibilas dengan air mengalir bertujuan
agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di obyek glass.
Kemudian ditambahkan safranin dengan menuangkannya dan dibiarkan selama 30
detik. Pewarna safranin merupakan pewarna sekunder atau kontras berfungsi untuk
mewarnai kembali sel sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan
alkohol. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif
dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya
 rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat
masuk sehingga sel berwarna ungu.Kemudian dibuang kelebihan safranin, dicuci
dengan air mengalir, dan dikeringkan dengan hair drier.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat
berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah
rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga
proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).(Karmana, 2008)
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap
preparat dengan menggunakan air mengalir. Pembilasan ini bertujuan untuk
mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dengan menggunakan hair drier, agar air tidak tercampur dengan reagen atau
pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, preparat dikeringkan
dan ditambahkan minyak imersi pada preparat dan diamati di bawah mikroskop
dengan pembesaran lemah baru kemudian dibesarkan dengan pembesaran kuat ( 100X
). Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika
terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram
negatif.Hasil akhirnya, Staptyloeoccus aereusmerupakan bakteri gram positif yang
seharusnya berwarna ungu.
Pengamatan bentuk dan jenis bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan
terhadap sel. Kebanyakan sel-sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika di lihat di
bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras.Warna yang membedakan
antara bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif yaitu warna ungu dan merah,
bakteri tersebut akan menyerap warna ungu dikatakan sebagai Gram positif dan
menyerap dominan warna merah berarti Gram negatif. Hal itu disebabkan karena
perbedaan struktur dinding sel diantara keduanya. PengamatanStaphylococcus
aureus dengan perbesaran 100x bentuknya adalah kokus atau bulat termasuk dalam
bakteri Gram positif karena bakteri ini menyerap warna ungu dan dapat
mempertahankannya selama proses pewarnaan tersebut. Pewarnaan bakteri ini
dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.
VII. Kesimpulan
Dari hasil praktikum dan pengamatan pewarnaan gram dan morgologi bakteri dapat
disimpulkan bahwa :
1. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna merah muda
dan ada yang sedikit biru tua , morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri
ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
2. Terjadi penyimpangan warna, Staphylococcus aureus yang seharusnya berwarna ungu
atau biru tua tapi berubah menjadi merah yang disebabkan proses pengeringan yang
terlalu lama sehingga menjadi panas.
http://inasholihah2006-laporan-praktikumgizi.blogspot.co.id/2014/08/laporan-praktikum-
mikrobiologi-pangan_73.html

JUMAT, 30 JANUARI 2015

 LAPORAN PRAKTIKUM "MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN
MORFOLOGI BAKTERI"

A. Judul Praktikum
PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI

B. Tujuan Praktikum

Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan

mengelompokkan bakteri gram positif atau bakteri gram negatif serta menentukan
morfologinya.

C. Pendahuluan

1. Latar Belakang

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan
mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak
berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam
kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan
pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan
untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain
sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram
negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu
pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan
diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga
bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.

Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat
morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna
koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya. Oleh karena
itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri, morfologi koloni, dan uji
biokimia sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi bakteri.

2. Tinjauan Teori

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu cara untuk mengamati bentuk
sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari
pewarnaan tersebut ialah untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik

dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1999).

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain),
pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi,
2008). Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat,
sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada
mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral
(Lay, 1994).

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram
dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang
paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram
ini dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif (Pelczar & Chan, 1986).

Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk
noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu
mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada
noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram
Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan
alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri
tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai
kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap
berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang berwarna
merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999).

Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan oleh
adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding Gram Positif mengandung banyak
 peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung
lipopolisakarida(Suriawiria, 1999).

Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram
B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. Bakteri tahan asam merupakan bakteri
yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa,
tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA)
karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat.
Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium
tuberculosis (Pelczar & Chan, 1986)

Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni.
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil
tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan
melengkung (Hadioetomo, 1993).

D. Tinjauan Pustaka

Mikrobioligi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk hidup yang kecil, yang hanya
dapat dilihat dengan mikroskop (mikros= kecil, bios= hidup, dan logos= ilmu). Makhluk hidup yang
kecil ini disebut mikroba atau mikro-organisme. Bakteri berasal dari kata
latinbacterium (jamak, bacteria) , adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah
kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif
sederhana tanpa nucleus (inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitoondria dan kloroplas.
Istilah bakteria telah diterapkan untuk semua prokariota atau kelompok besar mereka,
tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan
dari semua organisme. Mereka tersebar (tersebar dimana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis
dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya
hanya berukuran 0,5 , meski ada jenis yang dapat mencapai 0,3mm. Meski umumnya memiliki
dinding, seperti sel tumbuhan dan jamur, tertapi dengan komposisi yang sanngat berbeda
(peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam strukturnya dari
flagella kelompok lain. Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van Leewenhoek pada tahun 1674.
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu
pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana el-
sel bakteri tersebut di suspensikan,. salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah degan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangakaian pengecatan (Entjang, 2003).

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk
tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau
lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat
berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup
dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 m. Bentuk bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat,
batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna
kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan
struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang
(silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,

memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri
dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana,
pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad
renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi
tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau
bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).

Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu: Gram
positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan demikian
warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna pertama tidak
bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan
oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)

Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah
setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding
sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel
bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi
kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam
eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang
menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol
gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain
yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri
itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan
jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram
negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol.
Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya,
sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks
karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini
menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya
zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan
warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna
dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif
dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat
warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain.
Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam
umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan
zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh
faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat
warna penutup (Sutedjo, 1991).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam
metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram.
Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian
larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum
digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di
antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat
pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+).
Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh
adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai,
muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa,
Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan.
Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai
bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang
saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).

Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark
Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial
karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk
identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet,
setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit dibilas
dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi
pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal
violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat
pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan
walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan
bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).

Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan
ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri.
Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai
dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan
berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal
iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu.
Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia,
Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif
akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada
bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella,
Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).

Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok
berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini
berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa
pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci
warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila
komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila
komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir
adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang
terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan
iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005).

Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri
Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka poripori akan
membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna.
Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan
mengecilkan poripori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki
dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding
selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 12 lapisan peptidoglikan
sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A
(violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium
iodide, Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Madigan,
2003).
 Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam),
pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan
kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula
volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali, 2009).

Memurut Pelezar and Chan, 2007 secra morfologi sel bakteri memnyai bagian-bagian
sebagai berikut:

1. Kapsul : lapisan tebal dari lendir yang membungkus sel. Fungsi kapsul adalah melindungi sel dari
kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sebagai sarana pengikat antar sel satu dengan yang
lainnya. Kapsul berhubungan dengan sifat patogenitas dimana bakteri yang berkapsul biasanya
bersifat patogen akan hilang/ berkurang. Hal ini terjadi karena kapsul melindungi bakteri dari dari
sistem imun tubuh, sehingga ketika bakteri masuk ke tubuh hospes, sistem imun tubuh tidak mampu
lelawan bakteri.

2. Dinding sel : bagian sel yang membungkus isi sel, terletak antara kapsul dan membran sitoplasma
dengan struktur sangat kaku. Tebal sel 10-35mm. Fungsi dindiing sel adalah pelindung sel dari
tekanan osmosis, memberi bentuk pada sel, dan berperann dalam reproduksi.

3. Membran sel/sitoplasma : lapisan tipis yang bersifat permiabel, fungsinya untuk mengatur zat-zat
masuk dan keluar sel.

4. Pili : benang-benag halus yang keluar dari dinding sel (seperti filamen tetapi bukan flagela).Jumlah
pili lebih banyak, lebih pendek, dan lebih kecil dari flagela.

5. Flagela : alat gerak dari bakteri terdiri dari rambut tipis yang mencuat menembus dinding sel dan
bermula dari dasar tubuh, merupakan suatu struktur granular yang tepat dibawah membran sel
dalam sitoplasma. Flagela terdiri dari tiga bagian yaitu tubuh dasar, struktur seperti kait dan sehellai
filamen panjang di luar dinding sel. Panjang flagel: beberapa kali panjang sel, namun diameternya
lebih kecil daripada diameter ssel (10-20).

6. Kromoson : merupakan pembawa sifat yang diturunkan pada sel anakan.

7. Krommosom : bakteri tidak terbentuk membran (DNA telanjang), biasanya terdiri dari satu sel DNA
yang sirkuler

8. Plasmit : bahan genetk tambahan yang bersifat otonom.

9. Ribosom : tempat sintesis protein.

E. Alat dan Bahan

1. Alat:

a. Pipet tetes
b. Kawat ose

c. Lampu bunsen

d. Mikroskop

e. Botol semprot

f. Cover Glass

g. Korek api

h. Object Glass

i. Kapas

j. Hair drier

2. Bahan:

1. Pewarna gram

a. Biakan murni

b. Garm A: Methylene blue

c. Gram B: Iodium

d. Gram C: Alkohol

e. Gram D: Safranin

f. Air

g. Minyak imersi

F. CARA KERJA

obyek glass difiksasi/diaseptiskan

 satu ose biakan kuman murni (bacilus sp.) diletakkan di atas obyek glass

diratakan biakan kuman murni dengan

jarum ose

difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2-3 kali dengan
cepat

dituangkan pewarna carbol gentian violet, biarkan selama 1 menit

dibuang sisa carbol gentian violet, dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat dengan membiarkan di udara terbuka/ dihair drier

dituangkan pewarna iodium, biarkan selama 2 menit

dibuang sisa iodium

dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat diudara terbuka/ dihair drier

 dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan sampai warna ungu hilang

dibilas dengan air mengalir

dituangkan pewarna safranin sebagai pewarna penutup/ pembanding biarkan selama 30 detik

dibuang kelebihan safranin

dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap

ditambahkan minyak imersi pada preparat dan amati preparat dibawah mikroskop dengan
perbesaran lemah (10 X) kemudian perbesaran kuat (100)

G. Data dan Hasil

KELOMPOK NAMA BAKTERI TERMASUK WARNA GAMBAR

GRAM (+) GRAM (-)

 7 Bacillus sp. Ungu

Berbentuk
batang (basil)

H. Pembahasan

Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan morfologi pada
bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dikerjakan di laboratorium
mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik
mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan
gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram
positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal
violet.

Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah
pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan
pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun
terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar
mendapatkan pengukuran yang akurat.

Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan
supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah di
cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil
dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika
terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka
bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi
tidak jelas.

Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses
fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak
akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah
bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue)
sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan
bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna
dari methylen blue.
 Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium. Gram B merupakan
larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga
pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut,
mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan
menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat
warna methylene blueakan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit
untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh
bakteri akan lebih baik (lebih kuat).

Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi
ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue dan KI pada
gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan
warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida
pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga
meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan
waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian
dilakukan pengeringan.

Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan

diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada
bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada
bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi
merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran
sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai
pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan
kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini
berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai
spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-
anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.

Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru.
Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur
dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol
(etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar
permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
 pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,

substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah
meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini
dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1994).

Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri jenis Bacillus sp.
merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif.

I. Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :

1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk membedakan
antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan
klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif
sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.

2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses
pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.

3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene blue sewaktu
prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.

4. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteriBacillus sp. merupakan bakteri
berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif .

J. Daftar Pustaka

Cappuccino, J., G., & Natalie., S, 1983, Microbiology A Laboratory Manual, Addison-

Wesley Publishing Company : New York.

Dwidjoseputro. 1994. Mikrobiologi untuk Universitas. Ganesha Expect. Bandung.

Gozali, Amir, 2009, Pewarnaan Gram, http://www.gozali.blogspot.com/ gram/pewarnaan

gram-prinsip.html . Diakses pada tanggal 14 April 2012.

Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jakarta.
 Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. United

State of America.

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book

Company: New York.

Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.

Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta.

Tracy,2005, GramStaining, www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf,

Diakses pada tanggal 18 April 2014.

Umsl, 2008, StainingBacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf,

Diakses pada tanggal 18 April 2014.

Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta

Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

Diposting oleh Silvi Rizqi Kurniawati di 07.13

http://dietistasilvi.blogspot.co.id/2015/01/laporan-praktikum-mikrobiologi.html

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI 1

BAB 1
PENDAHULUAN

1.1. LATAR BELAKANG

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negative, berdasarkan
sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan denmark hans Christian gram 1853-1938 yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.
Dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan empat macam pewarn aan dengan
fungsi yang berbeda yaitu :
Pewarnaan primer,(dapat memberikan warna pada semua jenis bakteri)
Pengikat (memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen dinding bakteri
 Penghilang warna (melarutkan sisa zat warna dan kompleks zat warna dengan lipid pada
dinding bakteri)
Pewarnaan pengganti (memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna
primernya.
Pada dasarnya bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu (tongkat), kokus dan spirilum. Bakteri
yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagianya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus
(bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setenggah
melengkung dan tidak melengkung.Stapylococcus aureus adalah bakteri gram positif yang
berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur.Beberapa
karakteristik yang dimiliki staphylococcus Aureuss diantaranya hemolytic pada darah agar,
catalase-oxidase-positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat
dan lingkungan NaCI pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim
coagulase. Selain itu, biasanya Stapylococcus aureus merupaka pathogen seperti bisul, styes
dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru, radang kelenjar dada, radang urat darah
serata menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi
makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan superantigens kedalam aliran darah.

E.coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mikrometer dan
diameter 0,5 mikrometer. Volume sel E.coli berkisar 0.6-0,7 mikrometer kubik. Bakteri ini
termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. Kita
mungkin banyak yang tidak tahu jika diusus besar manusia terkandung sejumlah E.colli yang
berfungsi membusukkan sisa makanan.

Pseudomonas auruginosa adalah aerob obligat yang tumbuh dengan mudah pada
banyak jenis media pembiakan, karena memiliki kebutuhan nutrisi yang sederhana. Medium
paling sederhana untuk pertumbuhannya terdiri dari asetat (untuk karbon) dan ammonium
sulfat (untuk nitrogen). Metabilisme bersifat respirator tetapi dapat tumbuh tanpa O2 bila
tersedia NO3 sebagai akseptor electron kadang-kadang berbau manis seperti anggur yang
dihasilkan aminoasetofenon. Beberapa strain menghemolisis darah. bakteri ini pada dasarnya
merugikan bagi pertanian, Bakteri ini juga memiliki karakteristik antara lain berwarna hijau
kebiru-biruan serta berbentuk batang.

1.2. MAKSUD DAN TUJUAN

MAKSUD
Maksud dari praktikum ini adalah agar mahasiswa :
1. Mengetahui prosedur kerja pewarnaan gram
2. Mengetahui bentuk-bentuk (morfologi) bakteri
3. Mengetahi sifat bakteri berdasarkan pewarnaan gram

TUJUAN
1. Membuat sediaan untuk pewarnaan gram
2. Melakukan proses pewarnaan gram
3. Mengamati morfologi dan sifat bakteri yang terdapat pada sediaan berdasarkan pewarnaan
gram
 BAB II
TINJAUN PUSTAKA

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi

atau pun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga
kontras mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.

Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam

laboratorium mikrobiologi guna pencarian dan identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram
memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif
berwarna ungu karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat warna kristal ungu-iodium,
sedangkan bakteri Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang
berwarna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur
dinding sel bakteri dan perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif
dan Gram negatif.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri
yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus
(bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah
melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan
gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri
gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah
(textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya
dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk
dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap
berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan

kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan
adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalanya mekanisme pewarnaan gram.
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting
dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri
yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan
yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna
safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode
pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif
(berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah).

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan
(mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri
gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet
 dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami
dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh
safranin.

Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan

sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang
sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram
adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri.

Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan
negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada
dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang
dapat menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna
ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet
setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat
warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh
perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)

Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap,
maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan,
yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan
alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang
tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif.
Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal
ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984)

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1) Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
2) Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk
melunturkan zat warna utama.
3) Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu
di antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan
karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu
Kristal ketika dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna
merah safranin, tampak bewarna merah (Zubaidah,2006).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
 Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.

Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu
muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding
selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan
terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin
masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol,
pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna
safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi
suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),
peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung
asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin

BAB III
ALAT BAHAN DAN METODE KERJA
 III.1 ALAT
1) Objek glass
2) Pipet tetes
3) Bunsen + korek api
4) Ose
5) Botol semprot
6) Bak pewarnaan
7) Mikroskop

III.2 BAHAN
1) CGV (Carbol Gentian Violet)
2) Lugol
3) Air Fuchsin
4) Oil emercy
5) NaCl 0,1 %
6) Aquades

III.3 SAMPEL
Biakan bakteri

III.4 METODE KERJA

1) Sediakan objek glass yang bebas dari lemak dengan jalan dilewatkan diatas api
Bunsen/spiritus 2-3 kali
2) Pijarkan ose dan ambil bakteri dari media, diletakkan diatas objek glass yan telah ditetesi
NaCl, di ratakan dengan putaran satu arah (melingkar/searah jarum jam)

3) Sediaan dikeringkan di udara

4) Setelah kering kemudian di fiksasi dengan jalan di lewatkan di atas lampu spiritus 2-3 kali
5) Sediaan siap untuk diwarnai
6) Sediaan kemudian diletakkan diatas bak pewarnaan
7) Sediaan di cat dengan CGV selama 2 menit
8) Bilas dengan air mengalir
9) Zat warna diganti dengan larutan lugol selama 45 detik
10) Bilas dengan air mengalir
11) Zat warna diganti dengan alkohol 96%
12) Bilas dengan air mengalir
13) Kemudian di cat lagi dengan safranin selama 1 menit
14) Bilas lagi dengan air mengalir
15) Keringkan dan lakukan pemeriksaan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Sebelum
melakukan pemeriksaan tambahkan oil emercy pada preparat tadi.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
 IV.1 HASIL PENGAMATAN

Ket. Gambar: Ditemukan bakteri gram positif basil dan coccus

IV.2 PEMBAHASAN
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik
dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan
antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh
karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan
asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia.
Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak)
di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel
terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (C.Gention Violet)

 Lugol(zat Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama
memperkuat reaksi
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
untuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (air fuksin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna
metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada
uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (C.Gention Violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan Lugo
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna air fuksin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif
memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan
bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 KESIMPULAN
Berdasarkan pengamatan yang di bawah mikroskop, maka dapat disimpulkan bahwa
pada sampel tersebut ditemukan bakteri berbentuk coccus dengan latar belakang hitam.

V.2 SARAN
Adapun sehubungan dengan praktikum ini, khususnya ditujukan bagi mahasiswa
yaitu:
1. Diharapkan bagi seluruh mahasiswa agar selama kegiatan praktikum ini berlangsung,
Mahasiswa harus menggunakan APD (Alat Pelindung Diri).
2. Diharapkan pula bagi semua mahasiswa, bahwa selama kegiatan praktikum ini berlangsung,
agar semua mahasiswa bersungguh-sungguh dalam melakukan praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Suriawira,U.1985. Mikrobiologi dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Volk, W.A. dan Margareth. F. W.1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Presscott. Lansing M. John P. Harley, Donald A klein.1993.Microbiology 2nd Edition USA :

WMC Brown Publisher.
http://israyantianur.blogspot.co.id/2013/05/pewarnaan-gram_31.html

pewarnaan bakteri
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang

Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti
(prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan spiral, serta
dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi, dari air, tanah,
udara, hingga dalam tubuhhewan, (Betsy dan Keogh. 2005). Bakteri umumnya tidak
memiliki pigmensehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak
kontrasdengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukanpewarnaan
agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop (Harleydan Presscot, 2002).
Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan langsungdengan pewarnaan basa,
pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif danpewarnaan gram (Dwidjoseputro,
2003). Pewarnaan basa adalah pewarnaanyang langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan
negatif adalah pewarnaan yangtidak langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar
belakang preparatbakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna
yangbersifat asam seperti nigrosin atau tinta cina (Harley dan Presscot, 2002).Pewarnaan
gram merupakan pewarnaan umum dalam bidang bakteriologi.Dengan pewarnaan ini,
kelompok bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakterigram positif dan bakteri gram negatif
(Ramona dkk, 2007). Hasil akhir daripewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan
berwarna ungu/biru,sementara bakteri gram negatif akan berwarna merah (Harley dan
Presscot,2002).

B. Tujuan

1. Untuk mengetahui morfologi sel bakteri yang digunakan saatpraktikum.

2. Untuk mengetahui cara membedakan bakteri gram positif dan gram

negatif melalui pewarnaan.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Pewarnaan garam atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang mengembangkan tehnik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan gram bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
 setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan
gram, suatu pewarnaan penimbang (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu yang
membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian
ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.

Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen,yang berarti mereka berbahaya
bagi organisme inang. Sifat potogen ini berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding
sel gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau
Endotoksin).

Tujuan pewarnaan yaitu :

Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupu fungi.

Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang di berikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia
yang ada akan dapat di ketahui.

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-
pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan
pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna
basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan
karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis
pewarnaan.

a. Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya
untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah
metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
 kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah
metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan
klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur
dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai
dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel
berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding
sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna
biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

 Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi
4%)

Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan

penisilin

Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat

pewarna basa (VK)

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana

kompleks

Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan

perlakuan fisik

(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson
dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen
blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu
deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi.
Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan

zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat
keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan
pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak
digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat
menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang
dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat
dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam.
Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru
metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh
permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak
sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-
7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan.
Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan
dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan
larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan,
dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).
4. Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur

khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan
khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum,
dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.
Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat
inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin,
radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan
endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap
dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan
transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit
dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)

a. Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air
dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang
berwana biru gelap.

b. Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.

c. Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

BAB III
PELAKSANAAN PRAKTIKUM
a. Bahan

Bakteri Salmonella sp.

Bakteri Staphylococcus aureus

 Kristal violet atau metilen blue

Alkohol

Safranin

Larutan iodium

b. Alat

Gambar alat Nama alat

Mikroskop

Ose

Pipet

bunsen

c. Prosedur kerja

a. Pengecatan sederhana

1. Teteskan ose suspense yang mengandung bakteri diatas gelas obyek yang bersih

2. Suspense ini diratakan sampai tipis, dengan diameter 1 cm

3. Kemudian kering anginkan hingga noda yang kering , lakukan fiksasi dengan cara
melewatkan gelas obyek pada nyala api berkali-kali

4. Tetsilah kristal violet atau biru metilen. Biarkan selama 1-2 menit, lalu cucilah dengan air
yang mengalir

5. Kemudian kering anginkan

6. Amati preparat dengan mikroskop pembesaran kuat (dengan minyak immersi) sel-sel
(bakteri akan berwarna biru sedang sporanya berwarna merah).

b. Pengecatan gram

1. Ambillah 1 ose suspense, keringkan diudara, dan fiksasi diatas nyala api

2. Tetesilah egnan kristal violet, biarkan 1-2 menit. Cucilah dengan air mengalir kemudian
keringkan diudara

3. Tetesilah dengan larutan iodium, biarkan 1-2 menit. Cucilah dengan air mengalir kemudian
keringkan diudara

4. Cucilah dengan alkohol (dengan cara meneteskan alkohol pada permukaan noda bakteri)
sampai air cucian tidak berwarna. Cucilah dengan air mengalir kemudian keringkan diudara

5. Tetesilah dengan safranin, biarkan selama 20 detik, cucilah dengan air mengalir lalu
keringkan diudara. Tutup permukaan preparat dengan gelas penutup

6. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat (dengan minyak ibbersi)

BAB IV
HASIL PENGAMATAN

Gambar pengamatan Keterangan

 Salmonella

Staphylococcus

Pewarnaan sederhana

BAB V
PEMBAHASAN
Praktikum ini memiliki tujuan agar praktikan terampil dalam melakukan pewarnaan
gram untuk bakteri gram positif dan negatif, mempelajari teknik pewarnaan gram untuk
pengamatan mikroba, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari hasil
pengamatan dengan pewarnaan gram, sera membedakan kelompok bakteri berdasarkan
reaksinya terhadap warna dan sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna
(Manurung, 2010).

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
 dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:

a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.

b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun,
formalin, fenol.

c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini
dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.

Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades
hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet
ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme
target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme
yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan
terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram
pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi
lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik
bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel
yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang
berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen
burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja.
Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda
sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan
pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung
bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut

kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades
hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi
memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan
warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan
membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding
sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine
yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri
menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas
(mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci
tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel
kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel
tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada
pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme
(bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol
96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%

gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel
terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)

gram - : lipid >> + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding
sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)

Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik
kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna
dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda.

Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya
diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1
menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin
merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada
bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin
tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat
berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang
waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses
identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap
gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi
kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-
masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan
kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan
diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah
mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan
jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram
negatif.

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-
senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel
bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar
pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.
Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika
warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa
adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada
umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai
sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna
basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel (Rudi, 2010).

Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna,

substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram
positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam
praktikum ini digunakan salah satu pewarnanya yaitu safranin yang sesuai teori bersifat
basa sehingga lebih mudah bersenyawa atau bereaksi dengan bagian-bagian inti sel
bakteri.

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna
metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada
uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
 muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010).

Pengamatan bentuk dan ukuran sel bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan
terhadap sel. Kebanyakan sel-sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika di lihat di bawah
mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras. Demikian pula bagian-bagian tertentu
misalnya spora, flagella, kapsul atau dinding sel hanya dapat diamati jika dilakukan
pengecatan atau pewarnaan khusus. Dengan pewarnaan ini, bakteri mula-mula dilapisi
dengan larutan zat warna karbol gentinviolet (karbol kristal violet, karbolmetil violet) dan
didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan yodium dan dibiarkan
terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pewarnaan ini selesai, semua bakteri
akan berwarna ungu.

Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuk

pemeriksaan mikroskopik ialah :

1. Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek.

2. Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, menyebabkan
mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.

3. Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau
reagen (pewarnaan diferensial).

Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan
memberikan reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut
berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negatif.

Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral.
Sehingga kalau kita memberikan pewarna yang bermuatan positif, misalnya metilen biru,
hasil pewarnaan akan nampak jelas.

Secara kimia, zat warna dapat digolongkan kedalam senyawa basa dan senyawa asam.
Jika warna terletak pada muatan positif, maka senyawa tersebut dinamakan zat warna basa.
Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan negatif, maka senyawa tersebut
dinamakan zat warna asam.

Contoh zat warna basa misalnya : metilen biru, safranin, merah netral dan sebagainya,
dengan anionnya adalah Cl-, SO2-4, CH3OO-, COOHOO-, dsb. Sedangkan zat warna asam
misalnya : Na-eosinat kationnya adalah Na+, K+, Ca2+, NH3. Disamping zat warna asam dan
zat warna basa, juga didapatkan zat warna indeferen seperti sudan III, dimetil-amid-azo-
benzol, dan zat warna netral seperti eusin-metilen biru.

Salah satu sifat dari zat warna untuk menggunakan pewarnaan mikroba ialah bahwa zat
warna asam pada umumnya mempunyai sifat bersenyawa lebih cepat dengan bagian-bagin
sitoplasma sel, sedang zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel.
 Faktor faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba ialah :

Fiksasi

Fiksasi dilakukan sebelum zat warna digunakan, bertujuan untuk :

v Melekatkan sel pada gelas objek.

v Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada sel
dalam keadaan hidup.

v Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif-NH3 yang akan bereaksi dengan
gugus OH- dari zat warna.

v Mencegah terjadinya otolitis sel, yaitu proses pecahnya sel yang disebabkan oleh enzim
yang ada didalamnya.

v Merubah daya ikat zat warna.

Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun pengeringan secara
dingin, sedangkan yang paling umum dilakukan secara kimia dengan penambahan sabun,
formalin, fenol, dan sebagainya.

Pelunturan warna

Pelunturan warna bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa
ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga
dengan jelas dapat dilihat dibawah mikroskop misalnya.

Pada umumnya sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan,
sedangkan sebaliknya sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk dilunturkan.
Sifat cepat dan lambatnya cara pelunturan inilah yang diperbedakan untuk membedakan
kelompok mikroba setelah diberi pewarnaan.

Dari segi ketahanan sel terhadap senyawa kimia, dibidang mikrobiologi dikeSnal ada tahan
asam, tahan alkohol, tahan air dan sebagainya. Ketahanan terhadap suatu zat kimia inipun
dipergunakan untuk membedakan kelompok mikroba.

BAB VI

JAWAB PERTANYAAN
1. Buat tabel yan berisi berisi urutan pewarna gram serta reaksi yang terjadi dan warna yang
terbentuk
 Reaksi bakteri
Zat warna dan urutan
pewarnaan Gram positif Gram negatif

Kristal violet / carbol Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu

gentian violet

Lugol Komplek KV-L Komplek KV-L

terbentuk dalam sel, terbentuk dalam sel,
sel tetap berwarna sel tetap berwarna
ungu ungu

Alkohol 70/96% Dinding sel dehidrasi, Lipid terekstraksi dari

pori-pori mengecil, dinding sel, pori-pori
daya serap dinding sel mengembang, komplek
dan membran KV-L KV-L keluar dari sel
tidak keluar sehingga sehingga sel tidak
sel tetap berwarna berwarna
ungu

Safranin Sel tidak berpengaruh Sel menyerap zat

sehingga sel tetap pewarna sehingga
berwarna ungu berwarna merah

2. Buatkan gambar sel bakteri (dan sporanya) dan beri keterangan (warna, bentuk dan ciri-ciri
lain)

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram Positif, tidak bergerak,tidak berspora dan
mampu membentuk kapsul. (Boyd, 1980), berbentuk kokusdan tersusun seperti buah
anggur (Todar, 2002) sebagaimana terlihat padagambar 2.4. Ukuran Staphylococcus
berbeda-beda tergantung pada mediapertumbuhannya. Apabila ditumbuhkan pada media
agar, Staphylococcusmemiliki diameter 0,5-1,0 mm dengan koloni berwarna kuning. Dinding
selnyamengandung asam teikoat, yaitu sekitar 40% dari berat kering dinding selnya.Asam
teikoat adalah beberapa kelompok antigen dari Staphylococcus. Asamteikoat mengandung
aglutinogen dan N-asetilglukosamin. (Boyd, 1980).

Salmonella berbentuk batang, tidak berspora dan tidak bersimpai tetapimempunyai flagel
feritrik (fimbrae), pada pewarnaan gram bersifat gram negatif, ukuran 2- 4 mikrometer x 0,5-
0,8 mikrometer dan bergerak. Padabiakan agar koloninya besar, bergaris tengah 2- 3
milimeter, bulat, agak cembung, jernih, lucin, dan tidak menyebabkan hemolisis (Gupte,
1990)

3. Berdasarkan ciri-cirinya, klasifikasikan jenis bakteri yang saudara amati

Staphylococcus:

1. Berbentuk bulat dengan diameter kira-kira 0,5-1,5 m.

2. Sel-selnya bersifat gram positif, dan tidak aktif melakukan gerakan (non motile)

3. Bersifat patogen dan menyebabkan lesi lokal yang oportunistik

4. Bersifat anaerob fakultatif

5. Menghasilkan katalase

6. Sebagian besar adalah saprofit yang hidup dialam bebas, namun habitat alamiahnyaadalah
pada permukaan epitel golongan primate / mamalia

7. Bersifat -hemolitik

8. Toleran garam (halodurik)

9. Meiliki protein A pada permukaannnya yang mengikat Fclg (menghambat fagositosis)

10. Menghasilkan pigmen kuning dan mungkin memproduksi eksotoksin.

Salmonella:

Salmonella sp. adalah bakteri batang lurus, gram negatif, tidakberspora, bergerak dengan
flagel peritrik, berukuran 2-4 m x 0.5-0,8 m. Salmonella

sp. tumbuh cepat dalam media yang sederhana (Jawetz,dkk, 2005), hampir tidak pernah
memfermentasi laktosa dan sukrosa,membentuk asam dan kadang gas dari glukosa dan
manosa, biasanyamemporoduksi hidrogen sulfide atau H2S, pada biakan agar
koloninyabesar bergaris tengah 2-8milimeter, bulat agak cembung, jernih, smooth,pada
media BAP tidak menyebabkan hemolisis, pada media Mac Concey koloni Salmonella sp.
Tidak memfermentasi laktosa (NLF),konsistensinya smooth (WHO, 2003) Salmonella sp.
tahan hidup dalam air yang dibekukan dalamwaktu yang lama, bakteri ini resisten terhadap
bahan kimia tertentu.

11.

BAB VII
KESIMPULAN
Percobaan kali ini didapatkan kesimpulan sebgai berikut:

1. Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaantersebut dapat
menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan
merah, sedangkan yang positif berwarna ungu.
2. Salmonella sp dari isolate ikan mentah termasuk bakteri gram negative,karena hasil
pengamtan secara mikroskopis berwarna merah.

3. Sel-sel bakteri secara khas berbentuk kokus, basil, dan spiral. Kokus adalahbakteri yang
serupa bola- bola kecil. Kokus yang bergandeng dua disebut diplokokus, yang
mengelompok berempat disebut tetrakokus. Basil adalah bakteri panjang berbentuk batang, yang
bergandengan panjang disebut streptobasil dan yang bergandeng dua disebut diplobasil. Spiral
adalah baktreri yang bengkok yang menyerupai spiral

DAFTAR PUSTAKA
http://claracreaweal.wordpress.com/2012/01/08/laporan-praktikum-mikrobiologi/

http://mikrolaborat.blogspot.com/2011/10/laporan-pewarnaan-bakteri.html

http://id.scribd.com/doc/84566410/Laporan-Praktikum-Pewarnaan-Bakteri

http://id.scribd.com/doc/89435484/Morfologi-FIX

http://sichesse.blogspot.com/2012/04/pewarnaan-gram-laboratorium.html

http://id.scribd.com/doc/54109009/31851981-Staphylococcus-Aureus

http://id.scribd.com/doc/42718100/Bakteri-Salmonella-Sp

http://liajegeg2.blogspot.co.id/2012/11/laporan-pewarnaan-bakteri.html

Laporan Mikrobiologi "Pewarnaan gram pada bakteri "

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PANGAN

PEWARNAAN GRAM PADA BAKTERI

Disusun Oleh :
1. Laeli Nur Istiqomah

NIM : P17431112067

2. Netty Ivada

NIM : P17431112059

3. Windi Wira Pertiwi

NIM : P17431112067

4. Yunita Sonia Octaviani

NIM : P17431112077

Reguler B / Semester 3

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES SEMARANG

PRODI D III GIZI

TAHUN PELAJARAN 2013/2014

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi
monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu
setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998).

Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan
 suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja
serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)

Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah
bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri
gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan
bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.
Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh
alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria,
2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

 Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan

penisilin

Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat

pewarna basa (VK)

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana

kompleks

Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan

perlakuan fisik

(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler.
Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk
mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung
pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna
tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam
alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif
dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan
Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam
dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol
fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya
dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna
tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih
atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat
warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3%
(hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan
air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang
sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air
mengalir (Karuniawati, 2005).

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini :

1. Mahasiswa mampu mengetahui jenis-jenis pewarnaan pada bakteri.

2. Mahasiswa mampu mengetahui larutan yang digunakan pada percobaan pewarnaan gram.

3. Mengetahui bentuk-bentuk bakteri melalui pewarnaan gram pada percobaan kali ini.

BAB II
ISI

A. Alat dan Bahan

Alat :

Mikroskop Bahan :

Batang ose bentuk bulat Bakteri steptococcus

Tabung reaksi Pewarna gram A

Pipet tetes Pewarna gram B

Rak tabung reaksi Alkohol 96 % (pewarna gram C)

Bunsen Zn- A (pewarna gram D)

Objek glass

B. Cara Kerja

1. Membersihkan objek glass dengan kapas/ tissue kemudian difiksasi diatas bunsen tapi jangan terlalu
dekat dan jangan terlalu jauh.

2. Menyalakan bunsen, selanjutnya memanaskan batang ose yang berbentuk bulat ke arah bunsen
sampai berwarna merah.

3. Selanjutnya setelah batang ose dipanaskan , saatnya mengambil bakteri yang berada didalam cawan
petri dengan kondisi didekat bunsen.

4. Meletakkan bateri yang sudah diambil ke dalam objek glass dan meratakannya.

5. Mewarnai dengan warna yang pertama yaitu pewarnaan gram A, dengan cara menetesi gram A ke
objek glass sampai semua bakteri tertutupi. Tunggu sampai 1 menit lalu bilas objek glass tersebut
dengan air mengalir.
6. Selanjutnya mewarnai kembali objek glas dengan pewarnaan gram B, dengan cara menetesi gram B
ke objek glass sampai semua bakteri tertutupi. Tunggu sampai 1 menit lalu bilas objek glass
tersebut dengan air mengalir.

7. Kemudian menambahkan alkohol sekitar 3-5 tetes ke objek glass. Tunggu sampai 30 detik lalu bilas
objek glass tersebut dengan air mengalir.

8. Yang terakhir adalah dengan menambahkan pewarna Zn-A ke objek glass sampai semua bakteri
tertutupi. Tunggu sampai 45 detik lalu bilas objek glass tersebut dengan air mengalir.

9. Menunggu sampai kering dan angin-anginkan.

10. Mengamati dengan mikroskop dan catat hasilnya.

C. Hasil Pengamatan

Teknik pewarnaan gram menghasilkan 2 warna , yaitu warna violet untuk bakteri yang berbentuk
batang dan warna biru untuk bakteri yang berbentuk coccus.

D. Pembahasan

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri

gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet
dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan
kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air
fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram
antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci
(Dwidjoseputro.1998).

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan
sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti
bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).

Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan
sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini
adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang
rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil
safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan
kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial
sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok
dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)
 Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk
mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya
(Lay,1994).

Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah dan
memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 100. Beberapa faktor kesalahan pada
praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak,
kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor
yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga
dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air.

BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan

Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :

Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup

Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna
ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada
dinding selnya

Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif dan pewarnaan
gram.

Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, gram A, gram
B, gram C, gram D, Zn-A, lugols iodida, dan safranin.

Diposting oleh Laeli Nur Istiqomah di 06.57

http://laelinuristiqomah.blogspot.co.id/2013/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan-gram.html