Pengertian

Teknik pewarnaan digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Teknik pewarnaan warna

pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan
negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau
jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis,
atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik
pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel
sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah
pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (waluyo,2010).

Langkah-langkah utama teknik pewarnaan

1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun,
formalin, fenol (pelezar,2008)

Macam-macam pewarnaan
1. Pewarnaan Negatif
Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan
negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana.
Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit
diwarnai, seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras
dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang
sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin
atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau
negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau
berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel
tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

Cara pewarnaan negatif

– Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop
Contoh hasil pengamatan

Bacillus subtilis
Perbesaran 400 Berwarna Kuning Berbentuk coccus

E.coli

Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan
tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan
selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal
violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin (lay ,1994). Pewarnaan sederhana
merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya
menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri
mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat
basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian
sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen
biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi
dua jenis pewarnaan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel
bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan
zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan sederhana ini adalah untuk melihat bentuk
sel.

Gambar di atas merupakan bakteri E. coli yang dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan
pembesaran 40x. Berwarna Ungu . Bentuk E. coli tampak seperti batang (basil) pendek yang
membentuk koloni yang tersusun seperti rantai yang memanjang.

Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan
bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pada
uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian
ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
 Zat warna utama (violet kristal)
 Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
 Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk
melunturkan zat warna utama.
 Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
9. Peka terhadap streptomisin
10. Toksin yang dibentuk Endotoksin

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam
tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
8. Tidak peka terhadap streptomisin
9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
 Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-Pewarnaan Bakteri 12
pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan
warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu
dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Hasil pengamatan

a. gram positif

b. gram negatif

Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi
sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya
karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat
tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu
bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab
tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam,
namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)

Pewarnaan Spora dan Kapsul

Pewarnaan diferensial merupakan teknik pewarnaan yang menampilkan perbedaan di
antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Teknik pewarnaan ini menggunakan tidak
hanya satu jenis larutan zat warna, berbeda dengan teknik pewarnaan sederhana (pewarnaan
tunggal) yang hanya menggunakan satu jenis zat warna saja. Pewarnaan diferensial banyak
jenisnya, antara lain ialah pewarnaan gram, pewarnaan spora, pewarnaan tahan asam, pewarnaan
giemsa, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagel. Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal
violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada
kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga
memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap. fungsi kapsul pada sel bakteri :
 Sebagai makanan cadangan

 Mencegah kekeringan

 Mencegah fagositosis

 Menunjukkan virulensi

 Kapsul sulit diwarnai karena adaya afinitas( daya serap) terhadap cat sangat kecil
Hasil pengamatan

Kapsul : bentuk kompak dan pasti

Lendir : bentuk tidak beraturan

Hasil bakteri seperti yang terdapat pada gambar ialah terdapat sel-sel bakteri yang
bewarna dan kapsul tampak kosong disekitar tubuh bakteri (mengelilingi bakteri), dan sekitar
kapsul berwarna gelap. Saat pengamatan bakteri ini relatif sukar karena apabila methylen blue
terlalu pekat, maka akan mengganggu proses pengamatan bakteri.

Kapsul dari berbagai spesies tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana atau
pewarnaan Gram. Karena, kapsul dari berbagi spesies berbeda susunan zat-zatnya, maka tidak
semua kapsul dapat diperlihatkan dalam pewarnaan yang sama. Misalnya, kapsul tidak memiliki
afinitas yang besar terhadap bahan-bahan zat warna yang bersifat basa.

Cat bakteri dan fiksasi