BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Pewarnaan merupakan salah satu cara yang paling sering digunakan untuk

membedakan mikroorganisme, khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif

dan gram negative. Kedua jenis bakteri dibedakan berdasarkan komponen

penyusun dinding sel. Selain tiu, pewarnaan spora dapat membedakan

ada/tidaknya spora dan letak dari spora tersebut di dalam sel (Untung, 2012).

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan

paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan

tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan

pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak

sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan

pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif.

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.

Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di

antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difensial. Dalam proses ini, olesan

bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan seperti zat pewarna

Kristal violet, larutan iodium, larutan alcohol (pemucat), dan zat pewarna

tandingannya (counter strain) berupa zat warna safranin. Hasil pewarnaan

pada bakteri Gram positif berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram

negative berwarna merah (Untung, 2012).

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu jenis pewarna untuk

mewarnai organisme. Zat warna yang akan digunakan umumnya bersifat

alkalin. Pewarnaan sedehana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan

bermacam-macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll),dari bahan-

bahan lainnya yang diwarnai (Hadiutomo, 1990). Hasil pewarnaan sel dengan

metoda ini menghasilkan satu warna. Zat warna yang dapat digunakan untuk

pewarnaan ini adalah biru metilen (30-60 detik) berwarna biru, Kristal violet

(10 detik) berwarna ungu dan fuchsin karbol (5 detik) berwarna merah.

Pada umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan ukuran

yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada kondisi secara kimiawi dan

kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi, sinar panas

dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat spora, yaitu

Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner. Pewarnaan spora

dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak spora ada tiga

macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel), terminal

( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal (letak spora diantara ujung-

ujung dan ditngah-tengah terminal).

Kapsula adalah bagian dari sel berupa lapisan tebal, lebih kental, dan

melekat kuat pada dinding sel. Kapsul dapat berfungsi sebagai pelindung

terhadap lingkungan yang kurang menguntungkan, sebagai cadangan

makanan, dan pengikat antar sel dalam satu koloni. Adanya kapsul melindungi
bakteri dan mekanisme kerja sel pagosit inang (sel yang mencerna benda

asing) dan kapsul tersebut menambah kemampuan bakteri untuk menginfeksi

Lapisan kapsul cukup tebal sehingga sulit diwarnai, oleh karena itu diperlukan

sutu pewarnaan khusus. Salah satu pewarnaan kapsula bakteri adalah dengan

pewarnaan bakteri (Dwidjoseputro, 2005).

B. Manfaat dan Tujuan Praktikum

1. Manfaat Praktikum

Memahami cara pengamatan untuk morfologi E.coli dan

Staphylococcus epidermidis dengan menggunakan metode pewarnaan

sederhana dan penggolongan E.coli dan Staphylococcus epidermidis

dengan menggunakan metode pewarnaan gram.

2. Tujuan Praktikum

a. Menerapkan teknik pewarnaan sederhana, pengecatan gram dan

pengecatan negative untuk pengamatan bentuk morfologi bakteri.

b. Menentukan pengoolongan bakteri dengan metode pewarnaan

gram.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Teori Umum

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur

dansifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup

hampirtidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada

disuspensikan. Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri

sehinggamudah di identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau

pewarnaan.Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu

mengetahuireaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau

pewarnaan (Dwidjoseputro, 2005).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat

macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan

diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau

jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna

pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan

sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel

microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial.

Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel

sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam

pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.

Namun, dalam percobaan kali ini, kami hanya menggunakan dua metode

pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram (Fitria, 2009).

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna

untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi

dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat

basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan

sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat

mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa

digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan

karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua

jenis pewarnaan (Lestari, 2013)

a. Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna

dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang

dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk

mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.

Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus

pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.

Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Suriawiria, 1999).
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif

dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.

Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans

Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun

1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella

pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan

zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,

sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu

pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang

membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah

muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini

berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan

mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol,

sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat

warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan
 berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram

negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua

jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel

bakteri.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan

terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol,

sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah.

Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan

yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel

menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap

menahan warna biru.

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu

dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak

ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif (Manurung,

2010)

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi

4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan

penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat

pewarna basa (VK)

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana

kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan

perlakuan fisik

A. Uraian Bakteri

1. Escherichia coli

E.coli merupakan Bakteri batang Gram negatif, tidak berkapsul,

umumnya mempunyai fibria dan bersifat motil. Sel E.coli mempunyai

ukuran panjang 2,0-6,0 mm dan lebar 1,1-1,5 mm, tersusun tunggal,

berpasangan. Bakteri ini dapat menggunakan asetat sebagai sumber karbon.

Bakteri ini tumbuh pada suhu antara 10-40 °C, dengan suhu optimum 37 ºC.

pH optimum untuk pertumbuhan adalah pada 7,0-7,5, pH minimum pada pH

9,0. Bakteri ini relatif sangat sensitif terhadap panas dan dapat diinaktifkan

pada suhu pasteurisasi makanan (50-100°C) atau selama pemasakan

makanan.

E.coli termasuk ke dalam golongan Bakteri Gram negatif, sifat dari

Bakteri ini yang membedakan dengan Bakteri lainnya adalah susunan

dinding selnya. Dinding sel Bakteri Gram positif berlapis tunggal dengan

kandungan lipid 1-4%, sedang pada Bakteri Gram negatif dinding selnya

berlapis tiga yang terdiri dari lipoprotein, membran luar fosfolipid dan

lipopolisakarida, dan kandungan lipid pada dinding sel berkisar antara 11-

22%. Membran luar fosfolipid tersebut menyebabkan komponen kimia yang

bersifat antiBakteri sulit untuk menembus dinding sel Bakteri Gram negatif

(Yenita, 2003).

Klasifikasi Escherichia coli

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Familia : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

2. Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis merupakan bakteri opotunistik yang

menyerang individu ketika sistem tubuh lemah. Ciri-ciri penting dari

Staphylococcus epidermidis adalah berbentuk kokus, berdiameter 0,5-1,5

µm. Staphylococcus epidermidis berkoloni mengerombol menyerupai

buah anggur, koloni biasanya berwarna putih atau krem. Bakteri ini

merupakan Gram positif (Pramasanti, 2008). Staphylococcus epidermidis

bersifat aerob fakultatif. Kuman ini tidak memiliki protein A pada

dinding selnya. Bersifat koagulasi negatif, dalam keadaan anaerob tidak

meragi manitol (Yenita, 2003).

Klasifikasi dari Staphylococcus epidermidis sebagai berikut :

Kingdom : Bacteria
Phylum : Firmicutes
Class : Bacili
Ordo : Bacillales
Family : Staphylococcaceae
Genus : Staphylococcus
Species : Staphylococcus epidermidis
 BAB III

METODE KERJA

A. Alat dan Bahan

1. Alat yang digunakan

Deck Glass, mikroskop, lampu spirtus, objek glass, ose bulat dan

lurus, pipet tetes, tissue

2. Bahan yang digunakan

Alkohol, ammonium oksalat 0,8g, aquadest, etanol 95% 20ml,

iodine kristal, kristal violet 20g, larutan NaCl 0,9%, minyak Imersi,

pottasium Iodine 1,0g, safranin, suspense Bakteri

B. Cara Kerja

1. Cara membuat preparat ulas biakan cair

Bersihkan kaca obyek dengan kapas alkohol, beri kode sampel

yang akan dibuat, pindahkan 2 mata ose suspensi bakteri ke bagian

tengah kaca obyek, ulaskan suspensi secara merata di permukaan kaca

obyek, biarkan preparat mengering di udara, fiksasi di atas api,

selanjutnya dilakukan pewarnaan bakteri.

2. Cara membuat preparat ulas biakan padat

 Bersihkan kaca obyek dengan kapas alkohol, beri kode sampel

yang akan dibuat teteskan 2 mata ose NaCl-Fisiologi ke bagian tengah

obyek, sentuhkan ose pada biakan bakteri, kemudian campur dengan

NaCl-fisiologi sehingga merata, ulaskan campuran ini di atas kaca

obyek, biarkan preparat mengering di udara, fiksasi di atas api,

selanjutnya dilakukan pewarnaan bakteri.

3. Prosedur kerja pewarnaan gram

Buatlah sediaan di atas kaca objek, keringkan pada suhu kamar dan

panaskan di atas nyala api 3-4 kali, dinginkan, letakkan sediaan di atas

rak pewarnaan, bakteri pada kaca objek ditetesi Kristal violet, lalu

dibiarkan 1 menit agar zat warna dapat diserap oleh dinding sel

bakteri, kemudian bilas dengan air, hati-hati jangan sampai bakteri

terbilas dengan air pembilas, bakteri pada kaca objek ditetesi solution

lugoli, lalu dibiarkan 1 menit, kemudian bilas dengan air, hati-hati

jangan sampai bakteri terbilas dengan air pembilas, cuci dengan

alkohol asam biarkan hingga warna violet menghilang, segera cuci

dengan air pembilas, bakteri pada kaca objek ditetesi pewarna

safranin, lalu dibiarkan 1 menit agar zat warna dapat diserap oleh

bakteri, kemudian bilas dengan air, hati-hati, jangan sampai bakteri

terbilas dengan air pembilas, ditetesi minyak imersi, diamatidi bawah

mikroskop (amati warna mikroba).

Catatan : bakteri gram (+) : ungu

 bakteri gram (-) : merah

4. Prosdur kerja pewarnaan sederhana

Buatlah sediaan di atas kaca obyek, keringkan pada suhu kmar dan

kemudian panaskan di atas nyala api 3-4 kali. Lalu dinginkan,

letakkan sediaan di atas rak pewarnaan, tuangkan larutan Methylen

Blue hingga menutup sediaan, diamkan 1 menit, buang larutan

dengan mencuci hinga warna hilang, kemudian keringkan, lihat di

bawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali , menggunakan

minyak imersi, hasil semua bakteri akan berwarna biru, bentuknya

akan terlihat jelas.

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

No Metode Pewarnaan Hasil Pengamatan Keterangan

.
1. Pewarnaan Sederhana Bakteri

(Staphylococcus epidermidis) berbentuk

kokus

2. Pewarnaan Gram Gram Positif

(Staphylococcus epidermidis)

3. Pewarnaan Sederhana (E. coli) Bakteri

Batang
4. Pewarnaan Gram (E. coli) Gram Negatif

B. Pembahasan

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna

untuk mewarnai organisme tersebut. Pewarnaan sederhana bertujuan untuk

melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan

selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa yaitu Methylen

Blue.

Pewarnaan gram adalah sebuah metode untuk mengkategorikan bakteri ke

dalam dua kelompok besar, yaitu bakteri gram-positif dan bakteri gram-

negatif. Kedua kelompok bakteri ini dikategorikan berdasarkan sifat kimia dan

sifat fisik dinding sel bakteri tersebut. Bakteri gram positif akan

mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua

di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna

crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna

safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang

digunakan dalam pewarnaan gram antara lain: crystal violet, iodine/lugol,

alkohol asam dan safranin.

Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana E.coli merupakan

bakteri berbentuk batang sedangkan Staphylococcus epidemidis berbentuk

kokus dalam pembesaran 100x. Kemudian pada pewarnaan Gram didapatkan

hasil bahwa E.coli adalah Bakteri Gram negatif (warna merah). Sedangkan

Staphylococcus epidemidis merupakan bakteri jenis Gram positif (warna

ungu).
 BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Dari hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa Escherichia coli

merupakan bakteri berbentuk batang dan salah satu jenis Bakteri Gram

negatif. Sedangkan Staphylococcus epidermis adalah bakteri dengan bentuk

bulat (kokus) dan merupakan Bakteri Gram positif.

B. Saran

Sebaiknya pemberian zat warna pada praktikum ini tidak berlebihan agar

sel bakteri lebih jelas. Selain itu, praktikan harus selalu memakai alat

pelidung diri agar terhindar dari kontaminasi bakteri.

 DAFTAR PUSTAKA

Afriyeni, Yenita. 2003. Jurnal Biologi Universitas Andalas (J. Bio. UA.)

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.

Fitria. 2009. Pengecatan tentang bakteri. Diambil dari:

http//wordpress.com/pengantartentangbakterihtml. Diakses 19 juni 2019.

Lestari. 2013. http//:wordpress.com/mikrobiologi-perwarnaan.pdf/ diakses pada

senin pada tanggal 20 Juni 2019.

Manurung. 2010. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Jakarta: Erlangga.

Pakadang, Sesilia.R. 2019. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum.

Jurusan Farmasi Politeknik Kesehatan Kemenkes Makassar

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.

Untung, 2012. http//:goole.com/Teknik isolasi bakteri.pdf/ diakses pada jum’at

tanggal 22 Juli 2019.