LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATAN

Dosen Pengampu : Putri Kartika Sari, M.Si

Nama : Try Herdina

NIM : 4820102220065
Kelas : Z
Prodi : S1 Farmasi

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

UNIVERSITAS BORNEO LESTARI
BANJARBARU

2023
 PRAKTIKUM 3
PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATAN

A. Tujuan
Setelah menempuh praktikum ini, mahasiswa diharapkan :
1. Dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderit baik itu
media cair maupun media padat.
2. Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri Gram positif
dan negatif.

B. Dasar Teori
1. Bakteri

Bakteri terdapat secara luas di lingkungan alam yang berhubungan dengan hewan,
tumbuh-tumbuhan, udara, air dan tanah. Pada kenyataanya sangat sedikit sekali
lingkungan yang bersih dari bakteri. Bakteri adalah mikroorganisme bersel tunggal tidak
terlihat oleh mata, berukuran antara 0,5 – 10 µm dan lebar 0,5 - 2,5 µm tergantung pada
jenisnya.

2. Staphylococcus aureus
Staphylococcus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat biasanya
tersusun dalam bentuk menggerombol yang tidak teratur seperti anggur. Staphylococcus
bertambah dengan cepat pada beberapa tipe media dengan aktif melakukan metabolisme,
melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan bermacam-macam pigmen dari
warna putih hingga kuning gelap. Staphylococcus cepat menjadi resisten terhadap
beberapa antimikroba (Jawetz, et al., 2001).

Gambar Bakteri Staphylococcus aureus

 Klasifikasi Staphylococcus aureus :
Kingdom : Protozoa
Divisio : Schyzomycetes
Class : Schyzomycetes
Ordo : Eubacterialos
Family : Micrococcaceae
Genus : Staphylococcus
Species : Staphylococcus aureus (Salle, 1961)
Staphylococcus tumbuh dengan baik pada berbagai media bakteriologi di bawah
suasana aerobik atau mikroaerofilik. Tumbuh dengan cepat pada temperatur 20 - 35ºC.
Koloni pada media padat berbentuk bulat, lambat dan mengkilat (Jawetz, et al., 2001).
Staphylococcus aureus mempunyai 4 karakteristik khusus, yaitu faktor virulensi
yang menyebabkan penyakit berat pada normal hast, faktor differensiasi yang
menyebabkan penyakit yang berbeda pada sisi atau tempat berbeda, faktor persisten
bakteri pada lingkungan dan manusia yang membawa gejala karier, dan faktor resistensi
terhadap berbagai antibiotik yang sebelumnya masih efektif (Spicer, 2000).
Staphylococcus aureus menghasilkan katalase yang mengubah hidrogen peroksida
menjadi air dan oksigen (Jawetz, et al., 2001).

3. Pewarnaan Gram pada Bakteri

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna
dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara
untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan
metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
(Jimmo, 2008).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya)
dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana”
dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna
saja (Gupte, 1990).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur
warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu
preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka
semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam
encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan
ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam
yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik
pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian
dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam
pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.
(waluyo,2010).
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan
cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan
pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati
dan granula fosfat (Entjang, 2003).
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas
dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan
salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).

Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :

a. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
b. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
c. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
d. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik
dan kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan :
a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.
b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia
seperti sabun, formalin, fenol.
c. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
Klebsiella pneumoniae.
 a. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,
yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat
bakteri terhadap cat tersebut.
b. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.
Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme
yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang
tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa
spesies tertentu dari genus Nocardia.
c. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat
lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel
tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga
sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti
pewarnaan sederhana atau Gram.
d. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1.) Zat warna utama (violet kristal). Dalam pewarnaan Gram di laboratorium
larutan gentian violet memiliki fungsi untuk mewarnai bakteri yang
termasuk ke dalam Gram positif yang mana bakteri berwarna ungu.
2.) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama.
3.) Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
4.) Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan
alcohol.
e. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan
membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida
dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol
memungkinkan hilang dari sel.
f. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang
tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-
3 nm).
g. Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu :
1.) Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran
zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol
memungkinkan hilang dari sel.
2.) Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan
yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya
tipis (1-3 nm).
3.) Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk
membantu determinasi suatu bakteri.
C Alat dan Bahan
Alat Bahan
 Objek glass  Alkohol 96 %
 Ose  Gentian violet
 Cover glass  Iodin lugol
 Lampu spritus  karbol funhsin/safranin
 Mikroskop  Bakteri Staphylococcus aureus

D Cara Kerja
1. Pembuatan preparat dari pertumbuhan media padat :
Teteskan satu ose kaldu pada objek gelas yang telah dibersihkan dan dibebaskan dari
lemak. Dengan ose steril ambil sedikit dari satu koloni kuman, campurkan dengan kaldu
tersebut, buatlah menjadi homogen, tipiskan. Preparat kemudian dikeringkan di atas nyala
api spiritus dan selanjutnya dikerjakan sebagai membuat preparat dengan bahan berasal
dari material langsung.
2. Cara melakukan pengecatan gram
a. Preparat yang telah siap dicat digenangi dengan cat Gram A (gentian violet) selama l
– 3 menit. Kemudian cat dibuang dan tanpa dicuci. Semua bakteri pada pengecatan
Gram A akan berwarna ungu scsuai wama cat Gram A.
b. Preparat digenangi dengan cat Gram B (iodin lugol) selama 1 /2 - l menit. Akibat
pemberian Gram B maka pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih baik. Setelah
itu cat dibuang dan preparat dicuci dengan air (leding).
c. Preparat ditetesi cat Gram C (alkohol 96%) sampai warna cat tepat dilunturkan.
Setelah pemberian cat Gram C maka akan terjadi :
1.) Bakteri Gram positif : tahan terhadap alkohol (ikatan antara cat dengan bakteri
tidak dilunturkan oleh alkohol) sehingga bakteri akan tetap berwarna ungu.
2.) Bakteri Gram negatif : tahan terhadap alkohol, sehingga warna ungu dari cat
dilunturkan dan bakteri menjadi tidak berwarna lagi.
d. Preparat digenangi dengan cat Gram D (karbol funhsin/safranin) selama 1 - 2 menit
Gram D bertindak sebagai warna kontras. Akibat dari pemberian Gram D maka :
 1.) Bakteri Gram positif oleh karena telah jenuh mengikat cat Gram A maka bakteri
tidak mampu lagi untuk mengikat Gram D sehingga bakteri akan tetap berwarna
ungu.
2.) Bakteri Gram negatif oleh karena warna cat Sebelumnya telah dilunturkan oleh
cat Gram C sehingga bakteri tidak berwarna lagi maka ia akan mengikat warna
cat Gram D sehingga bakteri akan berwarna merah.
Setelah itu preparat dicuci dan dikeringkan dalam udara kamar (dengan preparat
dalam posisi miring) dan setelah itu diperiksa di bawah mikroskop dengan
menggunakan pembesaran 100x.

E. Hasil Pengamatan
Gambar Hasil Pengamatan Keterangan
Warna sel bakteri : bakteri tidak nampak
Bentuk sel bakteri : bakteri tidak nampak
Susunan bakteri : bakteri tidak Nampak
Sifat gram : gram positif
Perbesaran : 100X
Metode pewarnaan : pewarnaan gram
Isolat bakteri Staphylococcus aureus

F. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pembuatan preparat dan pengecatan bakteri
Staphylococcus aureus menggunakan metode pewarnaan gram yang diamati menggunakan
mikroskop perbesaran 100X. Pewarnaan Gram bertujuan untuk mengamati morfologi sel
staphylococcus dan mengetahui kemurnian sel bakteri.

Namun pada praktikum ini morfologi sel isolat bakteri tidak nampak. Kemungkinan
disebabkan karena isolate yang sudah berumur satu bulan. Menurut teori, bakteri Staphylococcus
aureus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk kokus tersusun dalam kelompok-kelompok
tidak teratur (menyerupai buah anggur), dapat pula tersusun empat-empat (tetrad), membentuk
rantai (3-4 s e l), berpasangan atau satu-satu. Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram
positif dan berbentuk kokus yang menghasilkan warna ungu pada pewarnaan Gram. Warna ungu
disebabkan karena bakteri mempertahankan warna pertama, yaitu gentian violet. Perbedaan sifat
Gram dipengaruhi oleh kandungan pada dinding sel, yaitu bakteri Gram positif kandungan
peptidoglikan lebih tebal jika dibanding dengan Gram negatif (Fardiaz, 1993; Pelczar, 1998).
G. Kesimpulan

Dalam praktikum ini diperoleh kesimpulan bahwa morfologi sel isolat bakteri tidak
nampak. Kemungkinan disebabkan karena isolate yang sudah berumur satu bulan. Menurut teori,
bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berwana ungu, berbentuk kokus
tersusun dalam kelompok-kelompok tidak teratur (menyerupai buah anggur), dapat pula tersusun
empat-empat (tetrad), membentuk rantai (3-4 s e l), berpasangan atau satu-satu.
 DAFTAR PUSTAKA

Dewi, Amalia.K.2013. Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas Staphylococcus aureus terhadap
Amoxicillin dari Sampel Susu Kambing Peranakan Ettawa (PE) Penderita
Mastitis Di Wilayah Girimulyo, Kulonprogo, Yogyakarta. Jurnal Sain Veteriner,
ISSN : 0126 – 0421 Bulan Desember 2013.

Suharman. 2020. Bahan Ajar Mata Kuliah Mikrobiologi Umum, Fakultas Pertanian. Universitas
PGRI ;Yogyakarta.

Wasitaningrum, I.D.A. Uji Resistensi Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dari Isolat
Susu Sapi Segar Terhadap Beberapa Antibiotik. Skripsi. Universitas
Muhammadiyah Surakarta : 2009.