BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Visualisasi mikroorganisme yang masih hidup tidaklah mudah, tidak hanya karena
ukurannya yang sangat kecil tetapi karena transparan dan pada umumnya tidak berwarna jika
disuspensikan dalam medium cair. Untuk mempelajari sifat mereka dan untuk
mendiferensiasikan mikroorganisme dalam grup yang spesifik untuk kepentingan diagnostik,
pewarnaan bologis dan prosedur pewarnaan dengan bantuan mikroskop cahaya menjadihal
utama dalam mikrobiologi (Jawetz, 1995).
Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Bakteri rata-
rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron (1 mikron = 10
-3
mm). Itu
berarti pula bahwa jasad renik ini tipis sekali sehingga tembus cahaya. Akibatnya pada
mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Untuk melihat bakteri
dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan zat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan
bakteri (Irianto, 2006).
Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pengecatan sederhana maupun pengecatan gram
dan pengecatan spora serta mengetahui morfologi mikroorganisme.

B. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu untuk mengetahui antara gram positif dan
gram negatif melalui beberapa macam pengecatan.




















BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang
khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Yulneriwanti, 2013).
Isolat bakteri yang diperoleh diamati morfologi koloni dengan melihat bentuk koloni, warna,
tepian dan elevasi pada medium agar lempeng, agar tegak dan agar miring. Sedangkan morfologi
sel ditentukan dengan melihat olesan biakan yang sudah diwarnai dibawah mikroskop dan
melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram, dan kemampuan membentuk spora dari bakteri
tersebut (Pelczar dan Chan, 2006).
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan
di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya.
Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan
mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna
yang biasa digunakan untuk pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu:
pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk
menguji adanya komponen tertentu di dalam sel (Junaidi, 2013).
Uji pewarnaan bakteri yang menggunakan pewarnaan gram yang dilakukan dengan
menggunakan spesimen yang didapat dari rektal, feses, atau muntahan yang dikeluarkan oleh
hewan atau ternak yang terserang infeksi dari suatu bakteri. Pewarnaan diferensial yang sangat
berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran
sel bakteri (Kurnia, 2013).
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian
karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri
telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka
akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan
dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dan
sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (Mega, 2013).
Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini
disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan
terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan
oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya
perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna
yang sesuai dapat menembusendospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar
untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan
untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya (Mega, 2013).
Untuk memberi ciri pada berbagai kelompok bakteri perlu dipahami bahwa
semua ciri tidak sama pentingnya bagi semua kelompok. Sebagai contoh, pereaksi
pewarnaan gram penting bagi bakteri batang dan kokus tetapi bukanlah ciri pembeda bagi
Spiroketa. Ada tidaknya flagella serta penataannya penting bagi beberapa kelompok sedang bagi
yang lain tidak. Untuk beberapa kelompok , sifat-sifat biokimia lebih berarti daripada sifat
morfologi. Karena itu, untuk mencirikan
kelompok bakteri, janganlah mengharapkan adanya sifat-sifat yang sama (Yulneriwanti, 2013).
Menurut Irianto (2006) menyatakan bahwa ciri-ciri khas dari bakteri gram positif dan garam
negatif pada fenomena pengecatan adalah sebagai berikut :
a. Bakteri gram positif : sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan, sensitif terhadap
penisilin, resisten terhadap alkali; tidak larut oleh 1% KHO, biasanya kokus atau batang
pembentuk spora (kecuali Lactobacillus, Corynebacterium) dan dapat bersifat tahan asam (acid
tast).
b. Bakteri gram negatif : kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan, sensitif terhadap
streptomisin, sensitive terhadap alkali; larut oleh 1% KHO, biasanya batang tidak membentuk
spora (kecuali Neisseria yang berbentuk kokus) dan tampaknya tidak pernah tahan panas.
Bentuk bakteri bermacam-macam. Ada yang bulat (tipe kokus) dengan garis tengah 0,15-
1mikorn. Ada yang berbentuk batang atau slindris panjang atau pendek (tipe basil) dan ada yang
berbentuk slindris, spiral panjang atau pendek (spirillum) yang garis tengahnya 0,3-3 mikron,
sedangkan panjangnya 1 sampai lebih dari 6 mikron. Umumnya bakteri bersel tunggal tidak
mempunyai klorofil serta berkembang biak dengan cara membelah dan spora. Tiap sel dikelilingi
oleh dinding sel atau membrane yang menyerupai lendir. Jika berkelompok, wujudnya seperti
lendir yang kental dan berbentuktidak teratur, ada yang panjang, bulat, atau lapisan tipis seperti
buih. Bakteri itu ada yang inaktif atau tidak dapat bergerak. Ada pula bakteri yang bisa berenang
atau bergerak akibat adanya bulu-bulu yang bisa bergetar (Rizki,2013).
Bakteri gram positif lebih peka terhadap fenol, penisilin, dan resisten terhadap streptomisin.
Ciri khas ini dipergunakan dalam penggolongan bakteri (Dwidjoseputro, 2005).
Bakteri gram positif mengandung peptidoglikan kira-kira 90% dari bobot kering dinding
selnya. Namun biasanya terdiri dari selapis sel yang sangat tebal (10-50 nm). Selain
peptidoglikan dijumpai pula berbagai polimer polisakarida serta poliposfat yang dikenal sebagai
asam teitkoat (Hafsan, 2011).
Dinding sel bakteri gram negatif mempunyai susunan kimiawi yang lebih kompleks
dibandingkan dengan dinding sel bakteri gram positif. Dinding sel bakteri gram negatif
mengandung peptidoglikan yang terhitung rendah, jarang melebihi 10% dari bobot kering
dindingnya (Hafsan, 2011).
Kuman-kuman diklasifikasikan sebagai gram positif atau negatif berdasarkan responnya
terhadap pewarnaan gram. Prosedur pewarnaan ini, dinamakan menurut penemunya,
dikembangkan dalam suatu usaha untuk mewarnai kuman secara selektif dalam jaringan-jaringan
yang terkena infeksi. Sel-sel mula-mula diwarnai dengan kristal ungu dan iodium dan kemudian
dicuci dengan aseton atau alkohol. Langkah terakhir akan menghilangkan warna kuman-kuman
gram negatif tetapi tidak dari kuman-kuman gram positif (Jawetz, 1995).
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan
di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya.
Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan
mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna
yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu:
pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk
menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Yulneriwanti, 2013).
Pengecatan sederhana merupakan pengecatan yang menggunakan suatu jenis zat
warna. Bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri itu
tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun biakannya secara
keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai daripada
dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri terwarnai adalah organisme yang telah diwarnai
dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri
terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora
dan butiran (Kurnia, 2013).
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang
khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Junaidi, 2013).













BAB III
METODE PRAKTIKUM
A. Waktu dan Tempat
Adapun waktu dan tempat dillaksanakannya praktikum ini adalah:
Hari/ Tanggal : Senin/ 27 Mei 2013
Pukul : 08.30-12.00 Wita
Tempat : Laboratorium Kesehatan Hewan STPP Gowa
B. Alat dan Bahan
1. Alat
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu bunsen, cawan petri, gegep,
kaca preparat, mikroskop, pipet dan ose.
2. Bahan
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu air, alcohol 70%, biakan Eserchia
coli dan Bacillus subtilis, korek api, larutan crystal violet, larutan lugols iodium, larutan
methylen blue, larutan safranin, spiritus, tissue dan oil imersi.
C. Prosedur Kerja
1.Pengecatan Sederhana
a) Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70% agar bebas lemak.
b) Mengambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan ratakan diatas gelas
objek seluas 1 cm
2
.
c) Biarkan mengering diudara, lalu fiksasi diatas api spiritus.
d) Mentetesi dengan Methylen Blue dan Crystal Violet 1 2 tetes.
e) Biarkan selama 2 menit, lalu cuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa
cat tercuci seluruhnya.
f) Mengeringkan diudara dan mengamati hasilnya dengan pembesaran kecil
hingga besar dan menggambar preparatnya.
2.Pengecatan Gram
a) Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70% agar bebas lemak.
b) Mengambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan ratakan diatas gelas
objek seluas 1 cm
2
.
c) Biarkan mengering diudara,lalu fiksasi diatas api spritus.
d) Meneteskan larutan Gram A sebanyak 2 3 tetes dan biarkan selama 2 menit.
e) Mencuci dengan air mengalir, mengeringkan dengan kertas isap secara hati-hati.
f) Meneteskan larutan Gram B, biarkan selama 1-2 menit,
g) Mencuci dengan air mengalir, mengeringkan.
h) Meneteskan larutan Gram C, biarkan selama 30 detik.
i) Mencuci dengan air mengalir dan biarkan mongering.
j) Meneteskan larutan Gram D sebanyak 2-3 tetes, biarkan selama 1
menit, lalu cuci sengan air mengalir.
k) Mengamati dan mencatat hasilnya.


3.Pengecatan Spora
a) Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70% agar bebas lemak.
b) Mengambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan ratakan diatas gelas
Objek seluas 1 cm.
c) Membiarkan mongering diudara, lalu fiksasi diatas api spiritus.
d) Meneteskan Malacyt green berlebih dan membiarkan 15 menit tanpa
Pemanasan atau selama 5 menit diatas penanggang air. Juga agar cat warna
tidak mengering dengan meneteskan secara terus menerus bila cat mulai
mengering.
e) Mencuci dan mengeringkannya.
f) Meneteskan larutan safranin 1-2 tetes menunggu sampai 1-2 menit.
g) Mencuci dan mengeringkannya kemudian mengamatinya.












BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan
Adapun hasil pengamatan dari praktikum ini adalah :
1. Pengecatan sederhana
Laboratorium Keswan STPP Gowa Keterangan



Spesimen : Bacillus subtilis
1. Warna latar : Biru
2. Bentuk koloni : Stereptobacillus
3. Warna bakteri : Biru





Spesimen : Eserchia coli
1. Warna latar : Biru
2. Bentuk koloni : Sterepcocus
3. Warna bakteri : Biru




2.Pengecatan Gram
Laboratorium Keswan STPP Gowa Keterangan



Spesimen : Bacillus subtilis
Gram positif

1. Warna latar : Ungu
2. Bentuk koloni :
Monobacillus
Diplobacillus
Stereptobacillus
3. Warna bakteri : Ungu





Spesimen : Eserchia coli
Gram Negatif
1. Warna latar : Merah
2. Bentuk koloni :
Monococus
Diplococus
Stapilococus
Streptococus
Sarcina
3. Warna bakteri : Merah



3.Pengecatan spora
Laboratorium Keswan STPP Gowa Keterangan



Spesimen : Bacillus subtilis
1. Warna latar : Hijau
2. Bentuk koloni : Monococus
3. Warna bakteri :
Merah (sel negative)
Hijau (spora)



B. Pembahasan
1. Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau untuk memperjelas kontras
antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu
sendiri. Dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna.
Pada pengamatan ini, sel pewarna yang digunakan untuk melihat bakteri yang akan diamati
adalah Methylen Blue. Pewarna tersebut bekerja baik dalam mewarnai bakteri karena zat warna
tersebut mengandung fungsional yang membentuk warna. Pada pengamatan ini,
bakteri Escerchia Coli terlibat bentuk koloninya, yaitu stereptococus. warna latar biru dan warna
bakteri biru. Hal ini sesuai dengan pendapat Zubaidah (2006), menyatakan bahwa
bakteriEserchia coli termasuk bakteri gram negatif dengan warna merah. Sedangkan
untuk bakteri Bacillus subtilis, berwarna biru dan bentuk koloninya Stereptobacillus. Hal ini
sesuai dengan pendapat
Sri Mulyani (2010) menyatakan bahwa zat-zat warna yang digunakan pada pengecatan
sederhana biasanya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Pewarna yang
biasa dipakai dalam pewarna umum adalah biru metilen. Biru metilen memberi warna biru cerah
yang bisa bergradasi (biru muda sampai biru agak tua).
2.Pengecatan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar yakni gram positif dan gram negatif berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka. Dengan metode pewarnaan gram, bakteri dapat dikelompokkan
menjadi dua yaitu bakteri gram positif dan gram negatif.
a) Pengecatan Gram Positif
Pada pengecatan ini bakteri yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis. Pengecatan ini
menggunakan 4 (empat) jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, alcohol asam untuk
pencucian dan safranin sebagai zat penutup dan larutan iodium. Berdasarkan pecobaan Bacillus
subtilis bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan erat cat utama krystal
violet berwarna ungu, pada saat bakteri gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya
pada dinding sel dengan pemberian lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel,
pemberian alcohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan
didalam dinding sel disebabkan oleh rendahnya komponen lipid. Pada pengamatan dengan
menggunakan bakteri Bacillus subtilis menghasilkan warna bakteri ungu dan warna latar ungu
dengan bentuk koloni monobacillus, diplobacillus dan stereptobacillus. Hal ini sesuai dengan
pendapat Tryana, S.T (2008) menyatakan bahwa Ilmuwan dari Denmark bernama Hans Christian
Gram pada tahun 1884 mengemukakan bahwa bakteri gram positif akan mempertahankan zat
pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop dan
hal ini sama dengan hasil pengamatan yang telah diamati dibawah mikroskop.
b) Pengecatan Gram Negatif
Pada pengecatan ini digunakan bakteri Escerhia coli, pengecatan ini juga menggunakan 4
(empat) jenis larutan yaitu Kristal violet, sebagai cat utama, larutan iodium sebagai
pengintensifan, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan
percobaan diperoleh Escerchia coli bersifat gram negatif karena tidak dapat mengikat kuat cat
utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. Hal ini sesuai
dengan pendapat Zubaidah (2006) menyatakan bahwa bakteri gram negatif akan kehilangan zat
pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna
tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah.
Dengan demikian hasil pengamatan dengan literatur sama hasil warnanya yaitu berwarna
merah. Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif
dan berbentuk batang yang fermentatif.
3.Pengecatan spora
Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan penahan yang baik terhadap bahan kimia
sehingga spora sulit diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan cara dipanskan. Pemanasan
dimaksudkan agar lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna dapat masuk. Zat warna
yang digunakan yaitu larutan Malacyt green dan larutan safranin. Dalam hal ini safranin bukan
pewarna tandingan. Safranin mewarnai sel vegetatif dari bakteri. Sebaiknya dalam percobaan
malakit green digunakan dalam jumlah yang cukup banyak
Pada pengecatan ini digunakan bakteri Bacillus subtilis dengan menggunakan larutan
Malacyt green dan safranin untuk mengetahui sel negatif dan warna sporanya. Untuk melihat
sporanya terlebih dahulu dilakukan fiksasi diatas api spiritus kemudian diteteskan Malacyt green
selama beberapa menit. Setelah itu ditetesi larutan safranin kemudian diamati dengan
menggunakan mikroskop. Pada pengecatan spora dengan menggunakan bakteri Bacillus
subtilisdengan bentuk koloninya monococus dengan warna bakteri merah (sel negatif) dan warna
hijau menunjukan sporanya.
Hal ini sesuai pendapat Kurniawan (2010), menyatakan bahwa prinsip dari pengecatan spora
yaitu pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga warna utama dapat masuk ke
dalam spora sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan warna utama akan terperangkap di
dalam spora dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas
sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan berwarna merah.


















BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh dapat diketahui untuk membedakan bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif yaitu Bacillus subtilis karena bakteri
tersebut mampu mempertahankan cat utamanya sedangkan untuk bakteri gram negatif yaitu
bakteri Escercia coli karena tidak mampu mempertahankan cat utamanya ketika diberi peluntur.
Bakteri tersebut diamati melalui beberapa pengecatan yaitu pengecatan sederhana, pengecatan
gram dan pengecatan spora.
B.Saran
Adapun saran yang dapat saya sampaikan pada praktikum ini yaitu sampel yang diteliti
dilakukan dengan baik dan benar pada preparat agar memperjelas hasil pengamatan
serta mikroba yang hendak diamati diambil sedikit mungkin agar mikroba tidak bergerombol
sehingga morfologi mikroba tersebut lebih mudah untuk diamati.





DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.2005.
Hafsan.Mikrobiologi Umum. Makassar : Alauddin University Press.2011.
Irianto, Koes.Mikrobiologi Jilid 1. Bandung : CV. Yrama Widya.2006.
Jawetz, E, JL. Menick, EA. Adelberg. Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan
Edisi 16. Jakarta : EGC.1995.

Junaidi.2013.Pengecatan Gram pada Bakteri.http://wawan-junaidi.blogspot.com
/2009/07/pengecatan-gram-pada-bakteri.html.(28 Mei 2013).
Kurnia. 2010. Gram staining. http ://www. kurnia.blogspot.com. 28 Mei 2013.

Mega.2013.Pengecatan Marfologi Mikroba.http://megabohari.blogspot
.com/2011/12/laporan-mikrobiologi-pengecatan.html.(28 Mei 2013).

Pelczar, Michael J. Dan E.C.S Chan. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit
Universitas Indonesia. Jakarta.2006.
Rizki.2013..http://ngecatbakterimakul-rizki.blogspot.com//materi-kuliah.html.(28
Mei 2013).

Yulneriwanti.2013.Mikrobiologi Dasar.BlogYulneriwanti.http://01-bakteri.html.
(28 Mei 2013).

.