Laporan Praktikum Ke: 4 Hari/Tanggal: Selasa/ 18 Februari

Mikrobiologi Nutrisi 2020

Tempat Praktikum: Lab Biokimia,
Fisiologi, dan Mikrobiologi Nutrisi
Nama Asisten :
Martina Sihombing (D24160021)

PEWARNAAN GRAM
Ester Ayu Nadeak
D24170086
Kelompok 1/ G1

DEPARTEMEN ILMU NUTRISI DAN TEKNOLOGI PAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2020
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Bakteri merupakan salah satu golongan mikroorganisme prokariotik

(bersel tunggal) yang hidup berkoloni dan tidak mempunyai selubung inti namun
mampu hidup dimana saja (Jawetz et al 2004). Menurut klasifikasinya bakteri
dibagi menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Holderman
et al 2017). Bakteri tidak dapat dilihat oleh mata telanjang, ukuran mereka yang
sangat kecil menyebabkan kita tidak dapat melihat mereka, tetapi bakteri dapat
menyebabkan penyakit meskipun tidak dapat dilihat secara langsung. Salah satu
metoda sederhana untuk mengelompokkan tingginya keanekaragaman bakteri
adalah dengan pewarnaan bakteri (Rahayuningtyas et al 2017). Hal ini
dikarenakan bakteri sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai bakteri atau latar belakangnya. Zat warna
mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan (Lay 1994)
Identifikasi bakteri merupakan prosedur laboratorium yang digunakan
untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat diperiksa
dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi bakteri ini perlu, untuk
mengenal nama bakteri. Disamping itu juga perlu pengenalan sifat-sifat
fisiologisnya bahkan sifat-sifat fisiologis ini kebanyakan merupakan faktor
tertentu dalam mengenal nama spesies suatu bakteri. Sedangkan konfirmasi
bakteri yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya. Konfirmasi jenis
bakteri dapat menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi ensimatis atau reaksi
biokimia, terutama jika identifikasi menggunakan media masih meragukan/belum
memuaska. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-
zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif). Teknik pewarnaan pada bakteri
dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan
negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural (Jiwintarum et al 2016).
Pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahuistreuktur dan morfologi
sel bakteri serta untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif.
Perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram negatif menunjukkan bahwa
adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri
gram positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan peptidoglikan yang
tebal sedangkan bakteri gram negatif memiliki struktur dinding sel dengan
kandungan lipid yang tinggi (Fitri dan Yasmin 2011). Hasil pewarnaan Gram
dapat digunakan untuk mengetahui bentuk morfologi dari beragam jenis isolat
yaitu warna dan bentuk sel bakteri tersebut. Bentuk sel bakteri sangat penting
dalam mencirikan morfologi suatu spesies (Pelczar dan Chan 2005).
 Tujuan

Praktikum ini bertujuan mengetahui cara pewarnaan gram dan

mempelajari morfologi bakteri, serta mempelajari perbedaan bakteri gram positif
dan bakteri gram negatif.

TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan Gram

Teknik pewarnaan membagi bakteri berdasarkan perbedaan dasar dalam

struktur dinding selnya. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel seperti jala
yang tebal yang terbuat dari peptidoglikan (50-90% berat selubung sel),
sedangkan bakteri gram negatif memiliki lapisan yang lebih tipis (10% berat
selubung sel) (Jawetz et al 2013). Diantara berbagai macam bakteri yang dicat,
ada yang dapat menahan zat warna ungu (metilviolet, kristalvisolet, gentianviolet)
meskipun meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol atau aseton. Bakteri yang
memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri gram positif. Sebaliknya, bakteri
yang tidak dapat menahan zat warna setelah dekolorisasi dengan alkohol akan
kembali menjadi tidak berwarna dan diberikan pengecatan dengan zat warna
kontras, akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang
memperlihatkan rekasi semacam ini dinamakan bakteri gram negatif (Irianto
2006).
Tujuan dari pewarnaan Gram adalah untuk mengetahui morfologi bakteri
dan pengelompokan bakteri berdasarkan Gram positif dan Gram negatif.
Inokulum dioleskan pada kaca objek dan difiksasi di atas api hingga kering. Kaca
objek direndam dalam wadah yang berisi larutan kristal violet dan didiamkan
selama satu menit, kemudian kaca objek dimiringkan untuk membuang larutan
kristal violet sambil dibilas dengan aquades dan dikeringkan dengan tisu.
Selanjutnya kaca objek digenangi dengan larutan iodine selama dua menit dan
dibilas dengan alkohol 95% (aseton : alkohol = 1:1). Terakhir, kaca objek
digenangi dengan larutan safranin selama 30 detik dan bilas dengan aquades lalu
keringkan menggunakan tisu. Amati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100
kali pada lensa objek dan pembesaran 10 kali pada lensa okuler. Saat pemeriksaan
di bawah mikroskop, ditetesi dengan minyak emersi (Cappucino dan Sherman
1983) .

Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif pada umumnya memiliki struktur dinding sel yang
tebal (15-80 nm) dan sedikit lemak (1 – 4%). Dinding sel bakteri gram positif
memiliki peptodoglikan yang lebih banyak yang mampu mempertahankan zat
warna ungu sehingga warna ungu yang muncul pada pengamatan mikroskopis
terlihat kontras (Jiwintarum et al 2016). Berdasarkan pewarnaan seluruh isolat
bakteri potensial probiotik merupakan bakteri dengan gram positif yang mampu
mempertahankan warna ungu (kristal volet) setelah pelunturan dengan alkohol
aseton. Hal ini sesuai dengan Ginting et al (2015), yang menyatakan bahwa
bakteri yang menyerap Gram A (Kristal violet) akan tetap berwarna ungu setelah
pelunturan dengan Gram C (Alkohol aseton) disebut bakteri Gram Positif.

Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negatif memiliki dinding sel yang lebih tipis ( 10-15 nm)
dan persentase lemak lebih tinggi (11- 24%) daripada bakteri gram positif
dikarenakan bakteri gram negatif memiliki peptodoglikan sedikit yang mampu
menyerap warna merah hingga warna merah yang muncul pada pengamatan
mikroskopis terlihat kontras. Pada penggunaan cat gentian violet diperoleh
kualitas yang kurang baik karena warna ungu yang diserap oleh pori-pori pada
peptodoglikan dinding sel tidak sempurna sehingga pada pengamatan mikroskopis
terlihat kurang kontras (Jiwintarum et al 2016).

Jenis dan Morfologi Bakteri Rumen

Bakteri merupakan mikroorganisme rumen yang dominan. Bakteri pada

umumnya mempunyai ukuran sel 0,5-1,0 μm kali 2,0-5,0 μm, dan terdiri dari tiga
bentuk dasar yaitu bentuk bulat atau kokus, bentuk batang atau Bacillus, dan
bentuk spiral (Dwidjoseputro 1985). Dilihat dari fungsinya, bakteri dalam rumen
dapat dibagi menjadi 7 (tujuh) kelompok utama, yaitu (1) kelompok pencerna
selulosa, (2) kelompok pencerna hemiselulosa, (3) kelompok pencerna pati, (4)
kelompok pencerna gula, (5) kelompok pemakai laktat, (6) kelompok pembentuk
metan, dan (7) kelompok bakteri proteolitik (Purbowati et al 2014). Menurut tipe
dinding sel, bakteri ini berturut-turut dibedakan menjadi Gram-positif dan Gram-
negatif (Hasana et al 2015). Secara morfologis, bakteri selulolitik terpenting dan
lazim dijumpai dalam rumen terbagi kedalam bentuk coccus (Ruminococcus
flavefaciens dan R. albus) dan bentuk batang (Bacteroides succinogenes,
Butyrivibrio fibrisolvens dan Clostridium lochheadii), sedangkan. Di dalam
rumen, populasi bakteri berbentuk kokus adalah yang paling dominan dan
jumlahnya berkisar antara 50-89%, diikuti oleh bakteri berbentuk benang (45-
70%), bakteri berbentuk spiral (0-5%) dan bakteri berbentuk koma (0-4%)
(Mubarok 2009).

MATERI DAN METODE

Materi

Alat yang diperlukan dalam pewarnaan gram meliputi pembakar spiritus,

tabung hungate, kaca arloji, kaca objek, ose/syringe, cover glass, spidol,
mikroskop, dan tissue. bahan yang diperlukan dalam pewarnaan gram yaitu kultur
bakteri, kristal violet, safranin, larutan I2 dalam KI, minyak imersi.

Metode
 Pertama, Bersihkan gelas objek dengan tisu yang dibasahi alcohol 70%
dan gelas objek difiksasi diatas pemanas api spirtus sampai kering, kemudian
lingkaran dibuat dengan menggunakan spidol pada permukaan bagian bawah kaca
objek dan diberi tanda sisi kiri dan kanan agar tidak tertukar. Kedua, dengan
menggunakan ose/spoit, 1 lup atau satu tetes kultur bakteri yang akan dianalisa
diambil lalu oleskan/teteskan koloni bakteri ditengah lingkaran tadi (untuk bakteri
aerob tetesi dengan aquadest steril agar mudah ditipiskan) kemudian kaca objek
difiksasi diatas pembakar spirtus dengan gerakan memutar sampai kering tetapi
tidak hangus. Ketiga, larutan zat pewarna Kristal violet diteteskan keatas preparat
tadi sampai terendam dan biarkan selama 1 menit lalu bilas dengan aquadest
sampai air bilasan tidak berwarna biru lagi (ketika membilas dengan aquadest
aliran air jangan langsung mengenai preparat bakteri karena mungkin akan ikut
terbilas oleh air). Keempat, larutan I2 dalam KI diteteskan keatas preparat sampai
terendam dan biarkan selama 2 menit dan dibilas dengan larutan alcohol : aseton
1:1 sampai air bilasan tidak berwarna biru kemudia dibilas kembali dengan
aquadest untuk membersihkan sisa – sisa alcohol. Kelima, zat pewarna safranin
diteteskan kembali keatas preparat dan diamkan selama 30 detik lalu dibilas
kembali dengan larutan aquadest sampai bilasan air tidak berwarna merah
kembali, lap sisa cairan dengan kertas tisu jangan sampai preparat ikut terhapus.
Keenam, preparat dietetesi dengan minyak imersi sebanyak 1 tetes dan lakukan
pengamatan dengan mikroskop menggunakan lensa objektif perbesaran 100x dan
lensa okuler perbesaran 10x lalu gambar dan amati bentuk dan warna yang
dihasilkan. Setelah selesai, alat – alat yang digunakan dirapikan dan bersihkan
kembali kemudian lensa mikroskop dibersihkan menggunakan tisu.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Gambar 2. Literatur bakteri gram

poitif-coccus
Gambar 1. Bakteri A1 perbesaran Sumber: labsmk.com
100 x 10 (B. Gram positif)
 Gambar 4. Literatur bakteri Gram
Gambar 3. Bakteri A2 perbesaran negatif- basil
100x10 (B. Gram positif Sumber: docplayer.info
dan negatif)

Pembahasan

Pewarnaan gram adalah pewarnaan bakteri yang bertujuan untuk

membedakan bakteri menjadi dua kelompok yaitu, bakteri Gram positif dan
bakteri Gram Negatif. Menurut Sutedjo et al (1991). Bakteri Gram positif dengan
dinding sel berkandungan senyawa peptidoglikan lebih tebal dibandingkan pada
dinding sel Gram Negatif. Menurut Fardiaz (1989), dalam pewarnaan gram sel-sel
yang tidak dapat melepaskan warna dan akan tetap berwarna seperti warna kristal
violet yaitu biru-ungu disebut bakteri gram positif, sedangkan sel-sel yang dapat
melepaskan kristal violet dan mengikat safranin sehingga berwarna merah muda
disebut bakteri gram negatif.
Prinsip pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel mengikat zat
warna dasar (kristal violet) setelah pencucian dengan alkohol 70%. Keadaan ini
berhubungan dengan komposisi senyawa penyusun dinding sel. Pada bakteri gram
positif mengandung peptidoglikan lebih banyak dibandingkan bakteri gram
negatif (Fitrah et al 2017). Pewarnaan Gram bakteri dilakukan dengan isolat
murni yang kurang dari 20 jam. Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram
positif dan Gram negatif menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat
warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri Gram
positif terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif
mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri Gram
positif. Lipida ini akan larut dalam alkohol dan aseton yang digunakan sebagai
larutan pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya
larut kompleks kristal violet-yodium pada dinding sel bakteri Gram negatif ( Lay
1994). Persenyawaan kompleks kristal violet yodium ribonukleat yang tidak larut
dalam larutan pemucat akan terbentuk pada bakteri gram positif. Persenyawaan ini
tidak terbentuk pada bakteri Gram negatif sehingga diduga adanya perbedaan
kandungan asam ribonukleat antara bakteri Gram positif dan Gram negatif
(Hidayat dan Alhadi 2012).
Bakteri rumen terdiri dari jenis Gram positif dan Gram negatif Bila
hasil pewarnaan diperoleh bakteri berwarna merah maka bakteri tersebut adalah
bakteri gram negatif, sedangkan bila diperoleh bakteri berwarna ungu maka
bakteri tersebut adalah gram positif (Fitri dan Yasmin 2011). Spesies bakteri.
rumen yang termasuk dalam Gram positif antara lain Lactobacillus ruminis,
Lactobacillus vitulinus, Eubacterium ruminantium, Streptococcus bovis dan
Butyrivibrio fibrisolvens, sedangkan yang termasuk dalam Gram negatif antara
lain Prevotella sp., Ruminobacter amylophilus, Fibrobacter succinogenes dan
Treponema bryantii (Hasana et al 2015).
Pemberian larutan mordan atau yang digunakan adalah larutan lugol (I2
dalam KI) dimaksudkan untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Setelah
penambahan larutan lugol zat warna akan lebih jelas terlihat dan zat warna lebih
sulit dilarutkan.Penambahan safranin pada bakteri Gram negatif menyebabkan sel
bakteri berwarna merah, karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium
larut dan dinding sel kemudian mengikat zat warna kedua. Fungsi zat warna
safranin hanyalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna kristal violet,
sedangkan kristal violet berperan sebagai pewarna yang menyebabkan bakteri
gram positif bewarna biru keunguan (Hidayat dan Alhadi 2012)
Hasil pengamatan preparat dengan menggunakan mikroskop
menunjukkan bahwa bakteri A1 merupakan bakteri gram positif dan memiliki
bentuk kokus menyerupai bulatan-bulatan kecil yang membentuk kesatuan
(berkoloni) seperti anggur (bentuk Staphylococcus). Bakteri ini termasuk Gram
positif ditunjukkan oleh warna biru keunguan yang ditampilkan pada koloni
bakteri A1.Menurut Hidayat dan Alfandi (2012) Bakteri Gram positif berwarna
ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet-yodium tetap dipertahankan
meskipun diberi larutan pemucat.
Hasil pengamatan bakteri A2 menunjukkan bahwa bakteri A2
merupakan bakteri gram negatif dan memiliki morfologi berbentuk basil atau
batang dan hidup berkoloni (bergabung membentuk kesatuan). Bakteri ini
termasuk bakteri Gram negatif dan menunjukkan warna merah, ini dikarenakan
bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan
dinding sel bakteri Gram positif. Senyawa lipid akan larut setelah ditetesi etanol,
sehingga dapat menyebabkan permukaan dinding sel bakteri akan membentuk
pori. Terbentuknya pori tersebut mengakibatkan tidak dapat ditahannya komplek
kristal violet dari permukaan dinding sel bakteri setelah ditetesi etanol, sehingga
bakteri Gram-negatif dapat menyerap warna safranin, dan tampilan koloni bakteri
Gram Negatif akan terlihat berwarna merah muda.(Afrina et al 2016).

SIMPULAN

Teknik pewarnaan dilakukan dengan pengecatan atau pemberian zat

warna pada ulasan bakteri dan membagi bakteri berdasarkan perbedaan dasar
dalam struktur dinding selnya. Bila hasil pewarnaan diperoleh bakteri berwarna
merah maka bakteri tersebut adalah bakteri gram negatif, sedangkan bila diperoleh
bakteri berwarna ungu maka bakteri tersebut adalah gram positif. Hasil
pengamatan menunjukkan dua ulasan preparat merupakan bakteri Gram Positif
yang berbentuk kokus dan Bakteri Gram negatif yang bebentuk basil.
 DAFTAR PUSTAKA

Afrina, Chismirina S, Aulia CRP.2016. Konsentrasi hambat dan bunuh minimum

ekstrak buah kapulaga (Amomum compactum) terhadap Aggregatibacter
actinomycetemcomitan. J Syiah Kuala Dent Soc. 1 (2):192-200
Cappuccino JG, Sherman N. 1983. Microbiology: a Laboratory Manual.
California (US): Adison-Wesley Publishing Company.
Dwidjoseputro D. 1985. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta (ID): Djambatan.
Fardiaz S. 1989. Penuntun Praktek Mikrobiologi Pangan. Bogor (ID): IPB Press.
Fitrah R, Irfan M, Saragih R. 2017. Analisis bakteri tanah di hutan larangan adat
Rumbio. Jurnal Agroteknologi. 8 (1): 17-22.
Fitri L, Yasmin Y. 2011. Isolasi dan pengamatan morfologi koloni bakteri
kitinolitik. Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi. 3(2) :20-25.
Ginting SB, Suryanto D, Desrita. 2018. Isolasi dan karakterisasi bakteri potensial
probiotik pada saluran pencernaan ikan bandeng (Chanos chanos).Aquatic
Sciences Journal. 5(1): 23-29.
Hasana U, Nurmiati, Periadnadi. 2015. Karakterisasi Mikroflora Alami Saluran
Pencernaan Sapi Potong Sebagai Kandidat Probiotik Pakan Sapi Potong.
Jurnal Biologi Universitas Andalas. 4(2) :123-129.
Hidayat R, Alhadi F. 2012. Identifikasi Streptococcus equi dari kuda yang diduga
menderita strangles. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia. 17 (3): 199-203.
Holderman MV, de Queljoe E, Rondonuwu SB. 2017. Identifikasi bakteri pada
pegangan eskalator di salah satu pusat perbelanjaan di kota Manado.
Jurnal Ilmiah Sains. 17(1): 13-18.
Irianto K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Jilid 1. Bandung
(ID): Yrama Widya.
Jawetz E, Melnick J, Adelberg. 2004. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 23. Jakarta
(ID): EGC.
Jawetz E, Melnick J, Adelberg EA. 2013. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 25.
Penerjemah Elferia RN. Jakarta (ID): EGC.
Jiwintarum Y, Rohmi, Prayuda IDP. 2016. Buah naga (Hylocereus polyrhizus)
sebagai pewarna alami untuk pewarnaan bakteri. Jurnal Kesehatan Prima.
10(2): 1726-1734.
Lay BW. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium. Jakarta (ID): Raja Grafindo
Persada
Mubarok Z. 2009. Microbiology of The Rumen and Intestin. New Jersey (UK):
Prentice Hall.
Pelczar MJ, Chan ECS. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Jakarta: UI Press.
Purbowati E, Rianto E, Dilaga WS, Lestari CMS, Adiwinarti R. 2014.
Karakteristik cairan rumen, jenis, dan jumlah mikrobia dalam rumen sapi
Jawa dan peranakan Ongole. Buletin Peternakan. 38(1): 21-26.
Sutedjo MM. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta (ID): Rieneka Cipta.
Rahayuningtyas AD, Dewi W, Indrati. 2017. Pemanfaatan ekstrak etil asetat buah
merah sebagai zat pengganti pewarna primer pada teknik pengecatan
tunggal bakteri gram negatif batang. J Ked Gigi Unpad. 29(2); 138-144.
LAMPIRAN