LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM PADA BAKTERI

Dosen Pengampu Matkul Mikrobiologi

Bapak Drs. Adib Suyanto,MSi

Disusun Oleh :

Siti Maisah Hanani(P07133219085)

PROGRAM STUDI SARJANA TERAPAN

 KESEHATAN LINGKUNGAN

SEMESTER II

POLTEKKES KEMENKES YOGYAKARTA

2020

KATA PENGANTAR

Puji syukur kita panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa. Karena atas penyertaan-Nya sehingga saya
bisa menyelesaikan Laporan Praktikum mata kuliah Mikrobiologi yang berjudul Laporan Praktikum
Pewarnaan Gram pada Bakteri.

Kami berharap agar laporan praktikum ini dapat bermanfaat bagi mahasiswa dan pembaca pada
umumnya,sebagai salah satu sumber pengetahuan dan bahan pembelajaran tentang bagaimana cara
pewarnaan gram pada bakteri. Kami berharap agar makalah ini dapat bermanfaat bagi mahasiswa
dan pembaca pada umumnya, sebagai salah satu sumber pengetahuan .

Saya sangat berterima kasih kepada Bapak Adib Suyanto yang telah memberikan penugasan LFH (Learn
Form Home) pasca pendemik COVID-19 ini . Saya berharap laporan ini akan berguna bagi pembelajaran
khususnya pada Mata kuliah Mikrobiologi dan Parasitologi. Dan saya sangat berterima kasih dan sangat
senang apabila laporan ini dapat dimanfaatkan sebaik-baiknya dalam proses kegiatan belajar-mengajar.

Yogyakarta, 27 April 2020

Penulis

DAFTAR ISI

COVER…………………………………………………………………………….…...1

KATA PENGANTAR…………………………………………..……………………...2

DAFTAR ISI…………………………………………………....………………............3

BAB 1 PENDAHULUAN………………………………..……………………………..4

A. LATAR BELAKANG......................................................................................4

B. MAKSUD Dan TUJUAN................................................................................5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA………………………………………….……………6

Pewarnaan Pada Bakteri ………………………………………………….6

Perbedaan Bakteri gram negative dan gram positif……………………..7
Metode dalam pewarnaan bakteri ………………………………………..8

BAB III METODOLOGI…………………………………………………………..….9

Alat Dan Bahan………………………………………………………..…...9

Prosedur Kerja………………………………………………………..……9

BAB IV PEMBAHASAN……………………………………………………….....….11

Pembahasan…………………………………………………………..……11

BAB V PENUTUP…………………………………………………………..…………12

A. Kesimpulan....................................................................................................12

B. Saran...............................................................................................................12

DaftarPustaka……………………………………...………………….……………….13
 BAB I

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan mikroorganisme
yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan
dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu
cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempermudah proses
identifikasi bakteri.

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara
mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram.
Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak
bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan
penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan
fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans
Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena
menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu
mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram
negatif dan Gram positif. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu.
Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini
bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah.
Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi
yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai
kondisi menjadi baik (Rudi, 2010).

Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat
morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna
koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya. Oleh karena itu,
dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri, morfologi koloni, dan uji biokimia
sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi bakteri.
 Maksud Dan Tujuan

Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan bakteri gram positif atau
bakteri gram negatif

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan pada bakteri

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan
cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun
latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme
disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora
dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan
antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Anonim, 2008). Pewarnaan yang digunakan
untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan
untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi
kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen
yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam
(Dwidjoseputro.1998). Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan
pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus
cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004).

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran
jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang
diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).

Perbedaan bakteri gram negative dan bakteri gram positif

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat
pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan
antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada
umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif.

Perbedaan bakteri gram negative dan gram positif

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Metode dalam pewarnaan Bakteri

Metode-metode dalam pewarnaan gram :

Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, Kristal violet. Larutan iodine
kemudian ditambahkan, semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alcohol. Sel
gram positif akan tetap mengikat senyawa Kristal violet-iodine, tetap berwarna biru, sel warna
negatifwarna hilang oleh alcohol. Sebgai langkah terakhir, countersain (Mis.safranin pewarna merah)
ditambahkan, sehinnga sel gram negative yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras,
sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru. Dasar perbedaan reaksi gram adalah struktur
dinding sel.

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila
digunakan biakan tua, ada kemungkinan penyimpangan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak
sel mengalami kerusakan pada dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna
dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan
dinding yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan kompleks warna Kristal violet-iodine sehingga
terlihat sebagai bakteri gram negative (Lay,1994).
 BAB III

METODOLOGI

A. ALAT DAN BAHAN

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini yaitu:

a. Object glass
b. Bunsen
c. Bak pewarnaan

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini yaitu:

a. Kristan violet
b. Aquadest dan
c. Minyak imersi
d. Lugol
e. Alkohol
f. Mikroba yg akan diamati
g. Pewarna safranin
h. Tissue

B. CARA KERJA

1. Bersihkan/sterilkan objek gelas menggunakan alkohol kemudian dikeringkan menggunakan tissue

2. Lakukan pengambilan mikroba yang telah dibuat sebelumnya.

Pembuatan ratusan mikroba ini menggunakan bakteri atau mikroba yang telah dibiakkan pada media Na
dimana pengambilannya menggunakan jarum OC yang telah dipijarkan pada Bunsen. Hal ini bertujuan
agar jarum OC yang digunakan steril dari mikroorganisme lainnya. Sehingga pada saat pengambilan
mikroba dapat lebih sterril dari mikroorganisme lainnya.

1. Pengambilan mikroba ini diambil secara perlahan Dan teliti kemudian setelah didapat ditutup
kembali.
2. Setelah di dapat mikroba yang akan diamati letakkan pada object glass secara merata
3. Cerai beraikan beraikan bakteri tersebut menggunakan jarum Ose tadi.
4. Kemudian sterilkan kembali jarum Ose hingga pijar agar mikroba yang tadinya diambil bisa mati
Dan jarum Ose dapat steril kembali
5. kemudian lakukan fiksasi atau pembakaran ataupun pemanasan pada object glass yang dilakukan
dengan Cara melewatkannya diatas api Bunsen.

Hal ini bertujuan untuk membunuh atau mematikan bakteri tanpa merubah susunan atau structure
selnya.

1. Setelah itu jika dikira sudah cukup Kita dapat meneteskan pewarna Kristal violet diatas mikroba.

Kristal violet ini berfungsi untuk mewarnai bagian dalam sel bakteri atau mikroba lainnya.

1. Lalu didiamkan selama 2 menit,setelah 2 menit Kita bersihkan menggunakan aquadest.

2. Setelah bersih keringkan menggunakan tissue.
3. Selanjutnya lakukan penetesan lugol dimana lugol disini berfungsi sebagai penguat atau untuk
memperkuat pengikatan warna pada bakteri.
4. Kemudian dibersihkan kembali menggunakan aquadest.
5. Setelah dibersihkan menggunakan aquadest tetesi alkohol yang berfungsi untuk membilas zat warna
yang berlebih pada bakteri di abject glass.
6. Setelah diteesi alkohol berikan zat pewarna kedua/ sekunder yaitu safranin yang berfungsi untuk
mewarnai latar dari bakteri tersebut.
7. Lalu didiamkan selama 30 detik.
8. Setelah 30 detik bersihkan menggunakan aquadest agar zat warna yang berlebih dapat luntur
9. Kemudian keringkan menggunakan tissue .
10. Setelah kering kita dapat memberikan atau meneteskan minyak emersi disekitar bakteri. Minyak
emersi ini berfungsi untuk memperjelas saat dilakukan pengamatan dibawah mikroskop.
11. Preparat pun siap untuk diamati dibawah mikroskop.

BAB IV

PEMBAHASAN

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan
gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak
berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal
violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding
selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan
iodine (Lay.1994).

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga menyebabkan
perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci
(Dwidjoseputro.1998).

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis
noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan
obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).

Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai
conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah
counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin
dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa
berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak
membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua
jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991).

BAB V

PENUTUP

Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :

1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk membedakan
antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan
klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif
sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses
pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
 3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene blue sewaktu
prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
4. Dari praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa organisme yang yang dapat
menahan zat pewarna setelah dicuci dengan alkohol disebut organisme gram positif,
dimana indikasinya menunjukkan warna ungu pada bakteri itu sendiri

Saran

Dalam melaksanakan praktikum mengenai pewarnaan gram, diharapkan ketika dalam pemberia larutan
warna dilakukan secara hati-hati dan teliti, dan harus sesuai dengan prosedur yang telah ditentukan.

DAFTAR PUSTAKA

1. Link Youtube pewarnaan Gram Bakteri- https://www.youtube.com/watch?v=0oRd90eTso4

2. http://dwihryni.blogspot.com/2017/05/laporan-praktikum-pewarnaan-gram.html
3. http://dietistasilvi.blogspot.com/2015/01/laporan-praktikum-mikrobiologi.html
4. http://fitri-fykatili.blogspot.com/2016/10/laporan-praaktikum-pewarnaan-gram.html