Oleh
Kelompok 6
Fadilla Qatrunsalwa Nadifameidita
1152005006
Asisten :
1. Astari Dwi Jayanti
2. Hariastuti Prameswari
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
rahmat-Nya lah penulis dapat menyelesaikan laporan percobaan ini. Atas rahmat-Nya pula,
berbagai rintangan dalam proses penyusunan laporan percobaan ini dapat penulis lewati
sehingga laporan percobaan dapat terselesaikan dengan waktu yang singkat.
Terima kasih penulis sampaikan kepada seluruh pihak khususnya dosen, kordinator
asisten, asisten pembimbing dan teman-teman yang telah membantu dan memberikan
dorongan kepada penulis dalam menyusun laporan percobaan ini.
Kritik dan saran penulis butuhkan, agar kekurangan pada laporan percobaan
tambahan wawasan dan informasi bagi pembaca.
i
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR..........................................................................................................i
DAFTAR ISI............................................................................................................................ii
DAFTAR TABEL..................................................................................................................iii
BAB I PENDAHULUAN....................................................................................................1
1.2. Tujuan..................................................................................................................................2
5.2. Pembahasan........................................................................................................................17
BAB VI SIMPULAN.............................................................................................................19
DAFTAR PUSTAKA............................................................................................................20
ii
DAFTAR TABEL
iii
BAB I
PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroba atau mikroorganisme.
Karena ukurannya yang sangat kecil dan sukar dilihat oleh mata biasa, maka mikroba
hanya dapat dilihat menggunakan mikroskop. (Sumarsih, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup merupakan hal yang sangat
sulit, selain karena bakteri tidak berwarna, bakteri juga transparan dan kecil. Bakteri
yang hidup akan kontras dengan air dimana sel-sel tersebut disuspensikan. Untuk
mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan sebuah teknik pewarnaan bakteri,
sehingga sel mudah diamati. Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba
dengan teknik pewarnaan, dapat digunakan dua cara, yaitu mengamati sel mikroba
yang masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati mikroba yang telah mati dengan
diwarnai. Namun, yang paling banyak digunakan adalah mengamati mikroba dengan
diwarnai. Maka dari itu, teknik pewarnaan mikroba menjadi cara utama yang
digunakan dalam praktikum mikrobiologi pada umumnya.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spiral, dan sebagainya)
dapat dibedakan dengan mewarnai menggunakan zat pewarna. Mikroba sulit dilihat
dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang
menyebabkan berkembangnya teknik pewarnaan bakteri. Zat warna akan mengadsorbsi
dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat
ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur pada mikroba
yang diamati. Terdapat juga beberapa faktor pewarnaan yang akan dipelajari dan
dilakukan dalam praktikum kali ini. (Dwidjoseputro, 1994)
Pada praktikum kali ini, digunakan bakteri Bacillus sp untuk pengamatan dengan
empat teknik pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan
negatif dan pewarnaan spora.
1
1.2.Tujuan
Tujuan dari praktikum teknik pewarnaan mikroba adalah
1. Mempelajari teknik pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna.
2. Melihat bentuk-bentuk sel bakteri.
3. Mengetahui prosedur pewarnaan Gram.
4. Mampu membedakan bakteri gram positif dan negatif.
5. Mempelajari teknik pewarnaan negatif.
6. Mengamati letak spora bakteri.
2
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri adalah mikroba yang memiliki bentuk bervariasi seperti coccus, bacillus, dan
spiral. Dan pada umumnya, bakteri tidak memiliki pigmen sehingga bakteri tidak
berwarna. Untuk itu perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati
dengan mikroskop. (Dwidjoseputro, 1994)
Bacillus sp merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang dan dapat tumbuh pada
kondisi aerob dan anaerob. Sporanya tahan terhadap panas (suhu tinggi), mampu
mendegradasi xylan dan karbohidrat. (Gozali, 2009)
Beberapa penelitian telah berhasil mengisolasi dan memurnikan bakteri bacillus sp
gram positif diantaranya yaitu subtilin yang dihasilkan oleh bacillus subtilis, megacin yang
dihasilkan oleh B. Megaterium, coagulin yang dihasilkan oleh B. coagulans, dan tochicin
yang dihasilkan oleh B. Thuringiensis.
Pewarnaan pada bakteri dibedakan menjadi empat, yaitu pewarnaan sederhana,
pewarnaan gram, pewarnaan negatif dan pewarnaan spora.
2.1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan
pada praktikum mikrobiologi. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat
untuk mewarnai mikroba yang akan diamati. Pada umumnya bakteri mudah bereaksi
dengan pewarnaan sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik atau suka dengan
basa.
Pewarnaan sederhana biasanya menggunakan pewarna tunggal yaitu metal biru, basic
fuchsin dan kristal violet. Pewarnaan sederhana bertujuan untuk memberikan kontras
antara bakteri dan latar belakang. Pewarnaan sederhana dilakukan ketika kita ingin
mengetahui informasi tentang bentuk dan ukuran sel bakteri.
2.2. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif berdasarkan sifat fisik kimia dinding sel bakteri. Pewarnaan menggunakan pewarna
utama kristal violet dan pewarna tandingan safranin. Tujuan pewarnaan ini adalah untuk
memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri,
3
untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Pewarnaan ini dapat membagi bakteri menjadi gram positif dan gram negatif
berdasarkan kemampuannya untuk menahan pewarna primer (kristal ungu) atau kehilangan
warna primer dan menerima warna tandingan (safranin). Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negatif mengandung lemak dalam presentase lebih tinggi dan dinding
selnya tipis. Pemberian alcohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan
terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin
masuk kedalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram
negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan
alcohol, pori-pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga
pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel menjadi berwarna ungu, yang merupakan
warna dari kristal violet.
2.3. Pewarnaan Negatif
Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna asam seperti
negrosin, eosin, atau tinta cina sebagai pewarna utama. Pewarnaan negatif dilakukan pada
bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana.
Pewarnaan negatif bertujuan untuk memberi warna gelap pada latar belakang dan
tidak member warna pada sel bakteri. Hal tersebut dapat terjadi karena pada pewarnaan
negatif, pewarna yang digunakan adalah pewarna asam dan memiliki komponen
kromoforik yang bermuatan negatif. Sehingga pewarna tidak dapat menembus atau
berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena negative charge pada permukaan sel bakteri. Pada
pewarnaan negatif ini, sel bakteri terlihat transparan (tembus pandang).
2.4. Pewarnaan Spora
Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan
genus Clostridium. Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh vegetative bakteri disebut
sebagai endospora (endo:dalam, spora:spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh.
Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami
dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan
tambahan. (Aditya, 2010)
Dalam pewarnaan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus
dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksud tersebut adalah dengan 4
penggunaan larutan hijau malakit dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetatif juga
diwarnai dengan larutan safranin sehingga sel vegetatif ini berwarna merah, sedangkan
spora berwarna hijau. Dengan demikian, ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan
posisi spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat diidentifikasi. (Volk dan Wheeler,
1988)
5
BAB III
ALAT DAN BAHAN
6
3.3. Pewarnaan Negatif
Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum pewarnaan negatif adalah :
Tabel 3.3. Alat dan Bahan Praktikum Pewarnaan Negatif
No. Nama Alat Jumlah Nama Bahan Konsentrasi Jumlah
1. Bak pewarna 1 buah Biakan murni - -
Bacillus
7
BAB IV
CARA KERJA
menggunakan kawat.
8
No. Cara Kerja Gambar
5. Mencuci dengan air suling hingga luntur.
9
No. Cara Kerja Gambar
3. Mengoleskan mikroba ke kaca preparat
menggunakan kawat.
selama 1 menit.
melakukan fiksasi.
10
No. Cara Kerja Gambar
11
No. Cara Kerja Gambar
4. Meneteskan tinta cina di ujung kaca
preparat.
12
No. Cara Kerja Gambar
Sterilisasi kawat ose dengan membakar
menggunakan kawat.
diamkan 30 detik.
13
No. Cara Kerja Gambar
7. Mencuci dengan air suling selama 30
melakukan pengamatan.
14
BAB V
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
1. Bentuk : batang
Mikroba : bacillus
Bentuk : batang
1.
Warna : ungu
Gram : positif
15
5.1.3. Pewarnaan Negatif
Hasil pengamatan yang didapat pada praktikum pewarnaan negatif adalah :
Tabel 5.1.4. Hasil Pengamatan Praktikum Pewarnaan Negatif
No. Hasil Pengamatan Gambar
Mikroba : bacillus
1. Bentuk : batang
Pewarna : tinta cina
Pembesaran 50
Pembesaran 100
Mikroba : bacillus
1. Bentuk : batang
Letak spora : terminal (di ujung)
16
5.2. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan praktikum teknik pewarnaan bakteri
menggunakan empat percobaan, yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan
negatif dan pewarnaan spora. Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini yaitu bacillus
yang memiliki bentuk batang.
Percobaan pertama adalah pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana ini adalah
percobaan yang paling simpel pengerjaannya. Langkahnya yaitu dengan meneteskan
kristal violet sebagai pewarna tunggal kemudian mencucinya dengan air suling. Mencuci
dengan air suling bertujuan untuk melunturkan zat pewarna berlebih yang terletak pada
mikroba, karena praktikan hanya fokus mengamati bakterinya saja, tidak mengamati
daerah sekitar bakteri. Kemudian menambahkan minyak imersi bertujuan untuk
membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang
mendekati garis normal agar bakteri lebih sangat mudah untuk diamati.
Setelah dilakukan pengamatan, praktikan sangat sulit sekali untuk menemukan bakteri
dengan pembesaran 1000 kali. Untuk itu, dilakukan pengamatan mulai dari pembesaran 50
kali, kemudian 100 kali dan berlanjut ke pembesaran 1000 kali. Ketika melakukan
pengamatan, didapat bahwa bakteri bacillus berbentuk batang seperti rantai. Ada yang
menyerupai rantai putus-putus dan ada pula yang menyerupai rantai bersambung.
Percobaan kedua adalah pewarnaan gram. Langkah kerja yang dilakukan hampir sama
seperti pewarnaan sederhana, hanya saja terdapat penambahan lugol dan alkohol 96%.
Terdapat langkah fiksasi sebelum meneteskan alkohol untuk selanjutya preparat dibilas
dengan air suling, fiksasi pada percobaan ini berguna agar saat proses pembilasan oleh air
suling, bakteri pada preparat tidak ikut hilang terbilas.
Kemudian dilakukan pengamatan dengan mikroskop, hasil pengamatan didapat bahwa
bakteri bacillus berwarna ungu. Hasil pengamatan tersebut menunjukkan bahwa bakteri
bacillus tergolong dalam bakteri gram positif, karena setelah pembilasan dengan air suling
bakteri tersebut memiliki kemampuan dalam menahan warna primer (kristal ungu).
Percobaan ketiga adalah pewarnaan negatif. Pada percobaan ini, praktikan hanya
melakukan penetesan tinta cina pada ujung preparat, kemudian meratakan tinta cina
tersebut hingga menutupi bakteri. Saat meratakan tinta cina, tidak boleh terlalu tebal
hingga menutupi permukaan bakteri, karena akan mempersulit pengamatan. Tinta cina
pada percobaan ini tidak dapat meresap ke dalam sel bakteri, namun hanya digunakan
17
untuk melatar belakangi bakteri sehingga bakteri yang terlihat pada pengamatan berbentuk
seperti rantai-rantai panjang tidak berwarna (terlihat seperti bening). Tidak berwarna atau
bening tersebut lah yang membuat bakteri ini dinamakan negatif.
Percobaan terakhir adalah pewarnaan spora. Pada percobaan ini digunakan larutan
malachite green dan safranin. Larutan malachite green yang berwarna hijau dan larutan
safranin yang berwarna kemerahan akan diserap oleh bakteri sehingga pengamatan
menjadi lebih mudah. Dalam pengamatan, terdapat warna kehijauan yang terletak di ujung
bakteri dan warna kemerahan yang terletak diantaranya. Warna kehijauan ini lah yang
dinamakan spora, sedangkan warna kemerahannya adalah sel vegetatif dari bakteri. Hasil
pengamatan dari percobaan terakhir ini menunjukkan bahwa letak spora pada bakteri
bacillus adalah terminal (di ujung).
18
BAB VI
SIMPULAN
Simpulan yang dapat ditarik dari praktikum ini adalah sebagai berikut :
1. Digunakannya pewarna tunggal kristal violet dalam percobaan pewarnaan
sederhana.
2. Bakteri bacillus memiliki bentuk batang (basil).
3. Diketahui prosedur pewarnaan gram yang sama seperti prosedur pewarnaan
sederhana, dengan penambahan lugol, proses fiksasi, alkohol 96% dan pembilasan
dengan air suling.
4. Bakteri bacillus tergolong dalam bakteri gram positif.
5. Digunakannya tinta cina sebagai pewarna dalam percobaan pewarnaan negatif.
6. Letak spora pada bakteri bacillus adalah di ujung sel (terminal).
19
DAFTAR PUSTAKA
20