LAPORAN

PEWARNAAN GRAM

Disusun Oleh:
Yusi Ramaani/220.01005

PROGRAM STUDI S1 TEKNIK LINGKUNGAN

SEKOLAH TINGGI TEKNIK LINGKUNGAN MATARAM
TAHUN AKADEMIK 2021

i
 KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadiran tuhan yang maha esa atas
segala rahmat sehingga penulisan laporan yang berjudul “Pewarnaan Gram”
dapat terselesaikan dengan baik.

Penulis menyadari bahwa dalam tulisan ini masih banyak terdapat

kekurangan dan kelemahan, oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat
membangun sangat penulis harapkan, demi perbaikan di masa yang akan datang.
penulis juga mohon maaf atas segala kekeliruan baik yang di sengaja maupun
tidak disengaja.

Demikian yang dapat penulis sampaikan, semoga laporan praktikum ini

bermanfaat bagi penulis dan pembaca pada umumnya.

Mataram, 06 Desember 2021

Penulis

ii
 DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR.............................................................................................ii
HALAMAN PENGASAHAN................................................................................iv
BAB I PENDAHULUAN........................................................................................1
A. Latar Belakang.................................................................................................1
B. Tujuan..............................................................................................................2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA..............................................................................3
A. Pengertian dan Tujuan Pewarnaan..................................................................3
B. Pewarnaan Gram Bakteri.................................................................................3
C. Macam dan Fungsi Pewarnaan........................................................................4
D. Perbedaan Gram Positif dan Negatif...............................................................5
E. Faktor – faktor yang Mengaruhi Pewarnaan....................................................5
BAB III METODOLOGI.........................................................................................8
A. Waktu dan Tempat..........................................................................................8
B. Alat dan Bahan................................................................................................8
C. Metode.............................................................................................................8
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN...............................................................10
A. Hasil...............................................................................................................10
B. Pembahasan...................................................................................................10
a. Pembahasan Tabel 4.1.1. tentang Pengamatan Kenampakan Pewarnaan
Gram Bakteri..................................................................................................10
b. Pembahasan Gram Bakteri.........................................................................11
c. Proses dan Fungsi Tiap Bahan Pewarnaan Bakteri.....................................12
BAB V PENUTUP.................................................................................................13
A. Kesimpulan.................................................................................................13
DAFTAR PUSTAKA............................................................................................14
Lampiran................................................................................................................15

iii
 HALAMAN PENGASAHAN
1. Judul kegiatan : Pewarnaan Gram
2. Penyusun : Yusi ramadani

3. Laboraturium/bagian : laboraturium terpadu STTLmataram

4. Lokasi kegiatan : laboraturium STTL mataram

5. Waktu kegiatan : 30 November 2021

Mataram,06 Desember 2021

Penanggung jawab I Penanggung jawab II

Hijriati sholehah, S.Si., M.Si Nuerhidayah, S.Si., M.Ling

iv
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikroorganisme dapat dilihat dengan mikroskop biasa, tanpa diwarnai.
Pengamatan yang demikian (tanpa pewarnaan) lebih sulit dan tidak dapat dipakai
untuk melihat bagian  – bagian sel secara seksama. Mikroorganisme yang tidak diwarnai
tampak transparan bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat diperjelas dengan cara mewarnai sel  –  sel mikroba tersebut
dengan zat  – zat warna (Waluyo, 2008).
Macam dan fungsi pewarnaan menurut Pelczar dan Chan (2010), dibedakan
menjadi 3 macam yaitu :
 Pewarnaan Sederhana
Pemberian warna pada bakteri atau jazad-jazad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau
desain, yang sudah difiksasi dinamakan pewarnaan sederhana.
 Pewarnaan Diferensial
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba
atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial.Dengan
teknik ini biasanya digunakan lebih dari itu larutan zat pewarna atau reagen
pewarna.
 Pewarnaan Gram
Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling baik dan paling luas
digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Pewarnaan gram bertujuan
untuk mengidentifikasikan bakteri baik mengenai bentuknya maupun
sifat-sifat morfologinya. Dengan kata lain untuk memperlihatkan
bagian-bagian sel mikroba (Dwidjoseputro,1989).

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air,
dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Pengamatan tanpa pewarnaan
menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian sel dengan

v
teliti. Mikroorganisme yang telah diwarnai lebih mudah dikenali daripada
mikroorganisme yang tidak diwarnai, dan bakteri terwarnai berbeda-beda
berdasarkan perbedaan struktural dinding selnya (Sachne dan McPherson, 2004).
Bakteri merupakan salah satu mikroba yang termasuk prokariot. Bakteri
memiliki berbagai bentuk, ukuran dan penataan yang berbeda-beda.
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan melihat bentuk, ukuran dan
penataannya melalui pengamatan dengan menggunakan mikroskop. Bakteri yang
diamati lebih mudah terlihat di bawah mikroskop dengan mewarnainya.
Teknik yang digunakan untuk mewarnai bakteri salah satunya adalah
dengan teknik pewarnaan gram. Berdasarkan teknik ini bakteri akan diwarnai
dengan reagen sehingga dapat diketahui melalui penampakan bentuk sel, ukuran
sel, penataan selnya serta sifat fisika dan kimia bakteri terhadap zat warna
(Waluyo 2008). Teknik ini harus dilakukan sesuai dengan prosedur, bila tidak
sesuaidengan prosedur maka dapat terjadi kesalahan dalam mengidentifikasi
jenis bakteri tersebut. Oleh karena itu praktikan perlu mempelajari mekanisme
prosedur  pewarnaan gram.

B. Tujuan
Tujuan dari praktikum kali ini adalah praktikan mampu melakukan metode
pewarnaan gram bakteri dan praktikan juga mampu membedakan bakteri gram
positif dan gram negatif.

vi
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian dan Tujuan Pewarnaan

Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna
kepermukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiasakan cahaya,
sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.Zat warna yang
digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan memberikan
warna disebut Kromotor bermuatan positif, zat warna asam yang berperan memiliki
muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena memiliki muatan positif
antara lain Eosin, Congo Red dll. Contoh warna asam yaitu Crystal violet,
methylene Blue, Safranin, Base Fchsin, Malachite green dll (UNSEOD, 2008).
Pewarnaan adalah suatu cara kerja pewarnaan yang paling berguna dan membutuhkan
empat larutan dalam prosesnya yaitu zat warna penutup, zat warna larutan dan zat warna
pelunturan warna (Sutedjo,1991)

B. Pewarnaan Gram Bakteri

Muatan positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan negatif
dalam selsehingga mikroorganisme terlihat jelas .Prosedur pewarnaan yang
menghasilkan pewarnaan mikroba dinamakanpewarnaan positif . Dalam prosedur
ini dapat digunakan zat warna basa yangbermuatan positif maupun zat warna
asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya,pewarna negatif latar belakang di
sekeliling mikroba diwarnai untuk meningkatkankontras dengan mikroba yang
tidak berwarna.Zat warna atau cat biologi adalah persenyawaan organik untuk
mempunyaigugusan kromatofor dan gugusan auxokrom yang terikat dalam satu
cincin benzena.Gugusan kromatofor merupakan gugusan yang dapat memberikan
warna padamolekul cat, sedangkan auxokrom adalah zat yang dapat memberikan
disosiasielektrolit-elektrolit pada molekul cat sehingga cat beersifat lebih muah
bereaksi.Tujuan dari perwarnaan adalah :
 Memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop; 
 Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba;

vii
  Melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri, seperti dinding sel
danvakuola;
 Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat
warna.
Ada berbagai macam teori yang menjelaskan bagaiman mekanisme
pewarnaanmikroorganisme. Secara garis besar ada dua macam mekansme yakni:
 Berdasarkan atas mekanisme pengikatan kimia
Mekanisme ini menurut Ehrlich, Mayer, Heiden-Hain, Giemsa, dan lain-
lain.Menuurut teori pengikatan kimia, jaringan sel terdiri atas guguan
bersifatbasa dan gugusan bersifat asam , yang akan bereaksi dengan gugus asam
ataugusus basa zat warna (konstituen sel merupakan protein atau asam
aminoyang merupakan senyawa atmofter ).
 Berdasarkan mekanisme pengikatan fisika
Mekanisme ini menurut Fischer, appleyard, Freunlich dan lain - lain.
Menrutteori pengikatan fisika menyatakan bahwa peristiwa pengikatan
warnamerupakan proses absoprsi warna pada konstituen sel.

C. Macam dan Fungsi Pewarnaan

Pewarnaan sederhana (pewarnaan positif) menggunakan suspense bakteri encer,
sebelumnya difiksasi agar mematikan bakteri dan membuat lekat sel bakteri pada
objek glass tanpa merusak strukturnya.Pewarnaan negatif untuk bakteri yang sulit
diwarnai sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam Pewarnaan gram adalah
pewarnaan diferensial yang sangat berguna, dibedakan menjadi gram positif dan negatif.
Pewarnaan Endospora tujuannya untuk membedakan endospora dengan sel vegetative, sehingga
pembedaannya tampak jelas (UNSEOD,2008).
Menurut Setedjo et.al., (1980), macam-macam pewarnaan adalah
 Pewarnaan Tunggal
 Pewarnaan Negatif
 Pewarnaan Tahan Gram
 Pewarnaan Struktur Sel
 

viii
 Menurut Pelczar et.al., (1980), telah dikembangkan prosedur. Prosedur
pewarnaan :
 Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi organisme secara
kasar.
 Mengidentifikasi bagian-bagian sruktur sel mikroorganisme.
 Membantu mengidentifikasi dan atau membedakan organisme yang serup

D. Perbedaan Gram Positif dan Negatif

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel
tipis. Bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua
lapis membrane sel. Contohnya bakteri gram positif yaitu Bacillus subtilis dan
gram negative Contohnya :Eschenchia Coli (UNSOED,2008).
Perbedaan gram positif dan negative menurut Hadioetomo (1985), yaitu:
 Gram positif adalah organism yang dapat menahan komplek pewarna primer
ungu Kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel tampak biru
gelap atau ungu ).
 Gram negatif adalah organism yang kehilangan komplek warna ungu Kristal
pada waktu pembilasan dengan alcohol namun kemudian terwarnai oleh
pewarnaan tandingan safranain (sel tampak merah muda).

E. Faktor – faktor yang Mengaruhi Pewarnaan

Hasil pewarnaan tergantung beberapa faktor antara lain:
 Fiksasi
Sebelum mikroorganisme , khususnya bakteri di warnai harus
dilakukan fiksasiterlebih dahulu.
Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik denganpemanasan atau
dengan freeze drying atau dapat juga dilakukan fiksasi
denganmenggunakan agensia kimia.Agen kimia yang dapat dipakai antara
lain sabun, fenol, dan formalin. Fiksasiperlu dilakukan sebelum
perwarnaan mikroba berfungsi untuk :a.Merekatkan sel mikroba pada
gelas objek b.Membunuh mikroorganisme secara cepat dan tidak
menyebabkan perubahan – perubahan bentuk dan strukturnyac.Mengubah
afinitas (daya ikat ) zat warnad.Membuat sel- sel mikroba lebih

ix
kuate.Mencegah otolisi self.Mempertinggi sifat reaktif gugus – gugus
tertentu .
 Peluntur
Zat WarnaPeluntur zat warna adalah suatu senyawa yang
menghilangkan warna dari selyang telah
diwarnai . Peluntur zat warna (decolorizer ) berfungsi untuk
menghasilakan kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Ditinjau dari
kekuatan ikatan antara seldengan zat warna maka dikenal beberapa istilah,
misalnya tahan asam , tahan alkoholdan tahan air. Istilah tahan asam
digunakan bila zat warna telah diikat kuat oleh sel sehingga tidak dapat
dilunturkan warnanya oleh asam, demikian pula tahan alkoholdan tahan air
masing- masing tidak dapat dilunturkan oleh alkohol dan air.
 Intensifikasi Pewarnaan
Zat warna dapat diintensfikasi dengan beberapa cara misalnya dengan
mepertinggi kadar zat
warna, mempertinggi temperatur pewarnaan (60-90ºC) dan memambah
suatu mordan . Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebab
kansel - sel mikroba dapat diwarnai lebih intensif atau menyebabkan zat
warna terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan dengan cara
pewarnaan tanpa di berimordan.
 Substrat
Setiap zat warna apakah zat warna asam atau zat warna basa dapat
bereaksidengan konstituen
– konstituen sel tertentu. Oleh karena itu , substrat organik sepertilipida,
protein, asam – asam, nukleat dan karbohidrat juga mempengaruhi
pewarnaan.
Atas dasar macam zat warna yang diserap oleh sel, dapat dibedakan :
 Sel - sel yang basofil
 Sel - sel asidofil atau oksifil
 Sel - sel yang sundafonil
 Zat Warna Penutup atau Zat Warna Lawan

x
 Zat Warna Penutup atau Zat Warna Lawan adalah suatu zat warna basa
yangberbeda warnanya
dengan zat warna mula- mula digunakan. Fungsi dari zat warnapenutup
adalah memberikan warna pada sel yang berbeda warnanya dengan zatwarna
mula – mula (Waluyo 2010).

xi
 BAB III

METODOLOGI

A. Waktu dan Tempat

Hari/Tanggal : selasa, 30 Noveber 2021

Waktu : 09.00 s/d 12.00

Tempat : Laboratorium STTL Mataram

B. Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan antara lain object glass, kawat ose, lampu
spirtus, mikroskop, sarung tangan, rak tabung reaksi, pinset, dan kamera digital /
kamera HP. Bahan – bahan yang diperlukan yaitu pewarna gram (kristal violet,
iodine, alkohol 70%, dan safranin), biakan bakteri, akuades dan alkohol 70.

C. Metode
Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah pertama dengan
menyiapkan alat dan bahan yaitu object glass, kawat ose, lampu spirtus,
mikroskop, sarung tangan, rak tabung reaksi, pinset, dan kamera digital / kamera
HP. Selanjutnya preparat ulas (smear) yang telah difiksasi dibuat dari bakteri
dengan cara diambil sedikit bagian dari biakan bakteri dengan bantuan ose,
kemudian pewarna kristal violet diteteskan sebanyak 2 – 3 tetes sebagai pewarna
utama pada seluruh bagian preparat, dan ditunggu selama ± 1 menit. Lalu dicuci
dengan akuades yang mengalir dari botol semprot. Selanjutnya mordant (lugol’s
iodine) sebanyak 2 – 3 tetes, lalu tunggu selama ± 1 menit. Lalu cuci kembali
dengan akuades mengalir dari botol semprot. Selanjutnya diberikan larutan
pemucat (ethanol 70% / aseton) setetes demi setetes hinggal etanol yang jatuh
berwarna jernih, namun jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize). Lalu
dicuci kembali dengan akuades yang mengalir dari botol semprot. Selanjutnya,
counterstain (safranin) sebanyak 2 – 3 tetes dan ditunggu selama ± 45 detik. Lalu
dicuci kembali dengan akuades dengan akuades yang mengalir dari botol semprot.
Preparat dikeringkan dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan

xii
sampai merusak ulasan), lalu dibiarkan kering di udara. Sesudah itu di amati
dengan menggunakan mikroskop.

xiii
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Tabel 4.1.1. Pengamatan kenampakan pewarnaan gram bakteri
Sumber bakteri : E.coli
GAMBAR KETERANGAN
Preparat 1
Perbesaran 10 X
100
Hasil
Pewarnaan :
Kristal Violet
Jenis Gram
Bakteri : Gram
Positif
Bentuk Bakteri :
spirilium
Warna Bakteri :
Ungu

B. Pembahasan

a. Pembahasan Tabel 4.1.1. tentang Pengamatan Kenampakan

Pewarnaan Gram Bakteri
Dari hasil pengamatan biakan bakteri E.coli dapat diambil hasil
bahwa bakteri E.coli merupakan batang gram positif dari hasil pewarnaan
kristal violet. Bentuk bakteri yang di dapat adalah spirilium dan warna
bakteri adalah ungu. Tetapi dalam paraktikum kali ini pewarnaan bakteri
yang dilakukan mengalami sedikit kendala karena pada saat diamati
dengan mikroskop pewarnaan bakteri gram tidak jelas terlihat.

xiv
xv
b. Pembahasan Gram Bakteri
Escherichia coli merupakan bakteri gram positif, bersifat aerobik
dan anaerobik fakultatif, sering dijumpai didalam usus bagian bawah.
Escherichia coli bisa tumbuh dengan baik pada media yang lazim
digunakan di Laboratorium Mikrobiologi. Memberikan hasil positif pada
tes indol, lisin dekarboksilase dan fermentasi manitol serta memproduksi
gas dari glukosa.
E. Coli dari anggota family Enterobacteriaceae. Ukuran sel dengan

panjang 2,0 –6,0 μm dan lebar 1,1– 1,5 μm. Bentuk sel dari bentuk seperti
coocal hingga membentuk sepanjang ukuran filamentous. Tidak

ditemukan spora.. E. Coli batang gram negatif. Selnya bisa terdapat

tunggal, berpasangan, dan dalam rantai pendek, biasanya tidak
berkapsul.bakteri ini aerobic dan dapat juga aerobic fakultatif. E. Coli
merupakan penghuni normal usus, seringkali menyebabkan infeksi.

Kapsula atau mikrokapsula terbuat dari asam – asam polisakarida. Mukoid

kadang – kadang memproduksi pembuangan ekstraselular yang tidak lain

adalah sebuah polisakarida dari speksitifitas antigen K tententu atau

terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh banyak E. Coli seperti
pada Enterobacteriaceae. Selanjutna digambarkan sebagai antigen M dan
dikomposisikan oleh asam kolanik. Biasanya sel ini bergerak dengan
flagella petrichous. E. Coli memproduksi macam – macam fimbria atau
pili yang berbeda, banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas
antigen, antara lain filamentus, proteinaceus, seperti rambut appendages
di sekeliling sel dalam variasi jumlah. Fimbria merupakan rangkaian
hidrofobik dan mempunyai pengaruh panas atau organ spesifik yang
bersifat adhesi. Hal itu merupakan faktor virulensi yang penting.E. Coli
merupakan bakteri fakultatif anaerob, kemoorganotropik, mempunyai tipe
metabolisme fermentasi dan respirasi tetapi pertumbuhannya paling sedikit
banyak di bawah keadaan anaerob.pertumbuhan yang baik pada suhu
optimal 37ºC pada media yang mengandung 1% peptone sebagai sumber
karbon dan nitrogen. E. Coli memfermentasikan laktosa dan memproduksi

xvi
 indol yang digunakan untuk mengidentifikasikan bakteri pada makanan
dan air. E. coli berbentuk besar (2 - 3 mm), circular, konveks dan koloni
tidak berpigemn pada nutrient dan media darah. E. Coli dapat bertahan
hingga suhu 60ºC selama 15 menit atau pada 55ºC selama 60 menit.

c. Proses dan Fungsi Tiap Bahan Pewarnaan Bakteri

Hasil praktikum pengecatan gram pada bakteri yang terdapat di
preparat. Prosedur pertama dalam pengecatan gram adalah bakteri diberi
setetes kristal ovalet lalu dibilas dengan air kran, pada proses ini bakteri
berubah warna menjadi ungu, karbol ungu kristal diserap dalam dinding
sel dan protoplasma bakteri sehingga koloni bakteri menjadi berwarna
ungu.
Prosedur kedua adalah bakteri ditetesi dengan iodium, dan
kemudian dibilas dengan air kran, bakteri tetap berwarna ungu. Kompleks
ungu kristal iodium terbentuk didalam sel, sel tetap berwarna
ungu
Prosedur ketiga adalah pencucian bakteri dengan alkohol 70%,
tujuan  pencucian dengan alkohol adalah agar terjadi deferensiasi dari dua
macam bakteri. Pada bakteri gram positif dinding sel mengalami dehidrasi,
pori- pori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun,ungu
kristal iodium tak dapat keluar dari sel, sel tetap ungu,

xvii
 BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan
Kesimpulan yang didapat dari praktikum kali ini adalah praktikan mampu
melakukan metode pewarnaan gram bakteri dan praktikan juga mampu
membedakan bakteri gram positif dan gram negatif. Selanjutnya praktikan juga
dapat mengetahui bahwa bakteri E.coli adalah bakteri gram negatif. Bakteri gram
negatif merupakan bakteri dengan bagian dinding selnya yang dapat menyerap zat
warna merah. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan tipis yang terdapat
pada ruang periplasmik, yaitu antara membran luar dengan membran plasma.
Adapun contoh dari bakteri ini adalah E.coli. Sebenarnya bakteri gram negatif
memiliki sifat patogen sehingga lebih berbahaya jika dibandingkan dengan gram
bakteri positif.
Berdasarkan ciri – ciri bakteri gram negatif mempunyai sistem membran
plasma bakteri dilindungi membran luar dan membran dalam. Sementara bakteri
gram positif hanya memiliki membran plasma yang tunggal dengan dikelilingi
oleh dinding sel, yang tebal dari peptidoglikan. Hampir 90% dinding sel bakteri
gram positif ini tersusun dari peptidoglikan.

xviii
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjosaputro.2005. Dasar  – Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Dwijoseputro, Ratna S., 1998. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta, P.T
Gramedia Pustaka.
Hadioetomo, 1985. Mikrobiologi Dasar dalam praktek. Jakarta, P.T
GramediaPustaka.
Chuagestu, Agustian. 2015.
https://www.scribd.com/document/240739940/Pewarnaan-Gram. Diakses
pada 28 November 2016
Fitria, Hanifa. 2014. https://www.scribd.com/document/212398423/LAPORAN-
Pewarnaan-Gram. Diakses pada 29 November 2016

xix
Lampiran

xx