MAKALAH

SEDIAAN DAN PEWARNAAN BAKTERI

D
I
S
U
S
U
N
OLEH :
Nama : Suhaila Tsabitah Sihotang
Nim :12022201014
Dosen Pengampuh : Selamat Riadi,S.Si,M.si
Mata Kuliah : Mikrobiologi Dasar

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTRIAN REPUBLIK INDONESIA
MEDAN
TAHUN AJARAN 2022-2023
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kita panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmatnya bagi kita semua
terutama bagi kita semua dalam menyelesaikan makalah ini yang berjudul SEDIAAN DAN
PEWARNAAN BAKTERI. Dalam penyelesaian makalah ini banyak sekali kekurangan dan
kelemahan,untuk itu saya sangat mengharapkan kritik dan saran dari teman teman yang bersifat
membangun supaya saya dapat memperbaikinya.
Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi teman-teman semua dan dapat menambah wawasan dalam
memahami SEDIAAN DAN PEWARNAAN BAKTERI .
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut di suspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri
dalam keadaan hidup sangat sulit,sehingga untuk di identifikasi ialah dengan metode pengecatan
atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara
yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Perkembangan pengetahuan mengenai anatomi mikroskopis baik tentang hewan maupun

tumbuhan banyak diperoleh dari hasil pengembangan sediaan mikroteknik atau yang juga dikenal
sebagai sediaan Histologi. Sediaan yang digunakan berasal dari bagian yang sangat kecil dari suatu
organisme, namun secara keseluruhan suatu organisme dapat menjadi suatu sediaan utuh apabila
organisme tersebut cukup kecil untuk diamati menggunakan mikroskop. Mikroteknik merupakan
suatu ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan, atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan
ditelaah (Kardi, 1992).

Pada umumnya sediaan diwarnai dengan zat warna yang dapat memperjelas strukturnya. Dalam
mikroteknik dipergunakan bermacammacam zat warna, untuk membedakan secara kontras bagian-
bagian dari jaringan. Pada irisan jaringan hewan pewarnaan harus dapat membedakan mana yang
tulang, tulang rawan, otot, syaraf, jaringan ikat, dan inti dalam sel. Dalam pewarnaan suatu sediaan,
sering dipergunakan lebih dari 1 macam zat warna, kadang-kadang 3 sampai 4 macam zat warna.
Dalam anatomi tumbuhan penting untuk membedakan jaringan-jaringan berkayu dan yang tidak
berkayu. Dalam Histologi hewan pewarnaan penting untuk dapat membedakan dengan jelas inti dan
sitoplasma yang mengelilingi (Moebadi dkk., 2011). Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam
atau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan
ditelaah dengan mikroskop.

B. Rumusan masalah
1.Apa yang dimaksud dengan Sediaan?
2.Apa yang dimaksud dengan Pewarnaan?
3.Bagaimana bentuk bakteri pada pengecatan sederhana?
4. Fungsi pewarnaan ?
5. Cara membuat sediaan !
 BAB II
PEMBAHASAN

A.Sediaan
1. Definisi Sediaan
Sediaan adalah Sinonim: PREPARAT Lokasi : Tempat/ objek yang akan dilihat dibawah
mikroskop berupa bahan pemeriksaan. Sediaan yaitu sampel kultur bakteri yang diletakkan atau diulaskan
pada permukaan abick gelas/slide, yang dapat langsung dilihat dengan mikroskop atau harus diwarnai
terlebih dahulu tindakan atau proses pembuatan maupun penyiapan sesuatu menjadi tersedia, spesimen
patologi maupun anatomi yang siap dan diawetkan untuk penelitian dan pemeriksaan ( Dorland, 2002).
Objek glass berisi sampel penelitian, yang selanjutnya diamati menggunakan mikroskop sehingga
memudahkan pengamat dalam melakukan identifikasi (Latifa, 2015).bahan yang disiapkan secara
kimiawi ,sediaan; dengan ditemukannya penisilin pada tahun 1929, maka berkembang pulalah industri
farmakologi preparat obat-obat antibiotika. persenyawaan yang telah siap melalui proses kimia.

2. Fungsi Sediaan
Fungsinya sebagai untuk melihat bentuk sel, bentuk bakteri, gerak bakteri, morfologi bakteri dan
sifat bakteri, kontrol pelepasan dalam sediaan tablet floating, penambahan suatu bahan tambahan yang
berfungsi sebagai kontrol pelepasan dalam formulasi sediaan tablet floating. Salah satu bahan yang dapat
digunakan sebagai kontrol pelepasan dalam sediaan tablet floating adalah HPMC yang dalam
penggunaanya dikombinasi dengan amilum kulit pisang agung. Sediaan tablet dalam formulanya terdiri
atas bahan aktif dan bahan tambahan. Beberapa bahan tambahan antara lain bahan pengisi, bahan
pengikat, bahan penghancur, bahan pelicin, dan bahan pelincir. Salah satu tujuan penambahan bahan
tambahan dalam formulasi sediaan tablet adalah untuk melindungi, mendukung, dan meningkatkan
stabilitas dan bioavailabilitas bahan aktif (Hadisoewignyo dan Fudholi, 2013).

3.Jenis-Jenis Sediaan
MACAM-MACAM SEDIAAN
1. SEDIAAN HIDUP/BASAH YANG TIDAK DIWARNAI
dilakukan bertujuan untuk melihat bakteri bisa bergerak atau tidak dalam keadaan alamiah yang tidak te
rganggu.Dimana umumnya bakteri bergerak dengan flagella atau bulu cambuk.Dalam mengadakan peng
amatan terhadap gerak bakteri harus bisa dibedakan dengan gerak brown.Gerak bakteri dapat dibedaka
n menjadi 2 macam gerakan yaitu: Gerak Sejati,Gerak Semu (Gerak Brown)

2.SEDIAAN HIDUP/BASAH YANG DI WARNAI

Sediaan basah hidup diwarnai bertujuan untuk melihat protozoa atau telur cacing (Amoeba, Flagelata, Ci
liata). (Ex: Melihat sel epithel
3. SEDIAAN HIDUP DIMATIKAN DAN DIWARNAI (Ex: Persiapan preparat pewarnaan sederhana
dan differensial)

4.Cara Membuat Sediaan

Contoh cara pembuatan sediaan hidup/basah TIDAK DIWARNAI :
*Contoh Hasil Sediaan Diwarnai
B. PEWARNAAN
1. Definisi Pewarnaan

Pewarnaan adalah teknik yang digunakan untuk meningkatkan kontras dalam sampel, umumnya
pada tingkat mikroskopis. Noda dan pewarna sering digunakan dalam histologi, sitologi, dan di bidang
medis histopatologi, hematologi, dan sitopatologi yang berfokus pada studi dan diagnosis penyakit pada
tingkat mikroskopis. Arti kata pewarnaan dalam Kamus Besar Bahasa Indonesia (KBBI) adalah
pe.war.na.an proses, cara, perbuatan memberi warna, Pewarnaan adalah proses mempertajam suatu
elemen sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan nampak lebih jelas. Menurut Dewi et al., (2017)
proses timbulnya warna pada jaringan terikat dengan ikatan molekul antara zat warna dan jaringan. Zat
warna yang terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu sehingga
jaringan tampak terwarnai. Menurut Nurwanti, Budiono, dan Rinie Pratiwi P, (2013) setiap bagian dari
sel tumbuhan yang mempunyai zat warna memiliki sifat khusus, oleh karena itu sangat perlu mengenali
sifat-sifat zat warna.

2.Fungsi Pewarnaan

Pewarnaan adalah  prosedur pewarnaan diferensial yang dapat membedakan jenis bakteri
berdasarkan reaksi yang timbul pada struktur dinding sel selama prosedur pewarnaan. Pewarnaan Gram
dapat bermanfaat untuk mengidentifikasi spesies bakteri pada berbagai penyakit infeksi. Pemeriksan
Gram diindikasikan untuk memperoleh karakteristik dan klasifikasi bakteri yang berasal dari spesimen,
yang akan digunakan untuk pengambilan keputusan klinis lebih lanjut. Bakteri Gram positif memiliki
lapisan peptidoglikan tebal sehingga akan berwarna biru sampai ungu. Sedangkan bakteri Gram negatif
memiliki lapisan peptidoglikan tipis sehingga akan berwarna merah sampai merah muda.

3.Faktor-Faktor Keberhasilan Pewarnaan

1.Fiksasi, Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik dengan pemanasan atau dengan
freeze driying atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan menggunakan kimia seperti sabun, fenol dan
formalin. Fungsi fiksasi sebelum pewarnaan yaitu:
 Merekatkan sel mikroba pada gelas objek
 Membunuh mikroorganisme secara cepat dengan tidak menyebabkan perbahan-perubahan bentuk
dan strukturnya.
 Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna
 Membuat sel-sel mikroba lebih kuat (keras)
  Melepaskan granuler (butiran) protein menjadi gugu reaktif NH3+ yang akan bereaksi dengan
gugus –OH dari zat warna.

2. Pelunturan zat warna,Pelunturan zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel
yang telah diwarnai. Ini berfungsi untuk mengahsilkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop.
Ditinjau dari kekuatan ikatan anatara sel dengan zat warna, maka dikenal beberapa istilah, misalnya tahan
asam, tahan alcohol, tahan air dan lain-lain. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna telah diikat kuat
oleh sel sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh asam, begitu juga dengan tahan alcohol dan
tahan air masing-masing tidak dapat dilunturkan oleh alcohol dan air. Ada beberapa macam peluntur zat
warna, antara lain:
 Peluntur warna bersifat asam yakni HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran asam-asam tersebut 
dengan alcohol.
 Peluntur zat warna bersifat basa yakni KOH, NaOH, sabun dan garam-garam basa.
 Peluntur zat warna lemah, yaitu alcohol, air minya cengkeh, aseton dan gliserin
 Garam-garam logam berat AgNO3, CuSO4 dan lain-lain.
 Garam-garam logam riangan Na2SO4, MgSO4 dan lain-lain

3. Identifikasi pewarnaan,Zat warna dapat diidentifikasikan dengan beberapa cara misalnya dengan
mempertinggi kadar zat warna, mempertinggi temperature pewarnaan 60-90oC dan menambahkan suatu
mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan zat warna terikat lebih kuat pada
jaringan sel bila dibandingkan dengan cara pewarnaan tanpa diberi mordan. Ada beberapa mordan, yaitu:
 Mordan basa
 Mordan asam

4. Substrat,Atas dasar macam zat warna yang diserap oleh sel dapat dibedakan:
 Sel-sel basofil
 Sel-sel asidofil/ oksifil
 Sel-sel yang sudanofil

5. Zat warna penutup atau zat warna lawan,Zat warna penutup adalah suatu zat warna basa yang berada
warnanya dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Fungsi dari zat warna punutup adalah
memberkan warna pada sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna punutup
diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat
warna utama.

4.Jenis-Jenis Pewarnaan

PEWARNAAN BAKTERI ,Pewarnaan bakteri pada umumnya bertujuan untuk mempermudah

dalam pengamatanmorfologi bakteri dengan bantuan mikroskop. Bakteri umumnya tidak berwarna dan
hampirtidak terlihat karena kurang kontras dengan air dimana mereka mungkin berada. Pewarnaansangat
dibutuhkan untuk melihat bakteri dengan sangat jelas baik untuk pengamatanintraseluler maupun
morfologi keseluruhan.Pewarnaan terhadap bakteri secara garis besar, dibagi menjadi dua, yaitu:
1.Pewarnaan bakteri hidup
Pewarnaan bakteri hidup dilakukan dengan menggunakan bahan warna yang tidaktoksis tetapi jarang
dikerjakan karena bakteri hidup sukar menyerap warna.
Pewarnaan bakteri hidup dilakukan untuk melihat pergerakan bakteri, serta pemeriksaannya dilakukanden
gan menggunakan tetes gantung (hanging drop)

2.Pewarnaan bakteri mati

Pewarnaan terhadap bakteri yang telah dimatikan disebut  fixed state. Pewarnaan bakteri mati bertujuan
untuk melihat struktur luar bahkan struktur dalam bakteri, memperjelasukuran bakteri dan melihat reaksi
bakteri terhadap pewarna yang diberikan sehingga dapatdiketahui sifat-sifat fisik dan kimia dari bakteri
tersebut.Teknik Pewarnaan pada bakteri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :
1.Pewarnaan Sederhana

=Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna tunggal.Pewarna tunggal yang
biasanya digunakan dalam pewarnaan sederhana adalah Methylene Blue, Basic Fuchsin, Crystal Violet

2.Pewarnaan Negatif
=Pewarnaan Negatif adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna asam seperti Negrosin,
Eosin, atau Tinta India sebagai pewarna utama. 

3.Pewarnaan Diferensial

=Pewarnaan Diferensial adalah teknik pewarnaan yang dilakukan untuk

mengetahui perebedaan antara sel-sel dari tiap-tiap mikroba.

4.Pewarnaan Struktural

=Pewarnaan struktural ditujukan untuk melihat bagian tertentu bakteri.

5.Instrumen Pada Pewarnaan

 Mikroskop cahaya
 Kaca objek.
 Pipet.
 Api bunsen.
 Kertas saring.
 Inoculation loop.
 Minyak imersi.
 Peralatan Umum=  Refrigerator (lemad es) untuk penyimpanan bahan kimia dan media nutrien.
 Ent-Kast  Otoklaf atau pressure cooker.  Kompor Gas dan Lampu Spiritus.  Timbangan
biasa dengan akurasi 0,01 gr. Mikroskop.  Rak tabung reaksi.  Spatula untuk pengaduk dan
penimbangan bahan. Jarum inokulasi yang runcing dan bolong. Vortex.  Penghitung koloni
bakteri.  Tempat penyimpanan untuk alat-alat gelas yang telah disterilkan dan media nutrien. 
Kapas, aluminium foil, plastic wrap, kertas isap.  Baki, plastik, spidol, kertas label, kain
lap/serbet.
  Alat-alat =Gelas  Cawan petri  Tabung reaksi.  Gelas/labu erlenmeyer.  Gelas ukur. 
Corong gelas.  Pipet ukur dan pipet plastik.  Kaca bends dan kaca penutup.
 Bahan-bahan = Alkohol 70 % dan 90 %, spiritus.  Aquades steril.  Desinfektan (karbol, lisol,
spiritus, formalin, betadine, d1l)  Bermacam-macam zat warns untuk pewarnaan. - Bahan-bahan
media pertumbuhan mikroba (agar).

6. Zat Dalam Pewarnaan

Zat pewarna terbagi menjadi dua yaitu pewarna alami dan pewarna buatan. Beberapa pewarna
alami turut ikut menyumbangkan nilai nutrisi (karotenoid, riboflavin, dan kobalamin), bumbu (kunyit dan
paprika) dan pemberi rasa (karamel) ke bahan olahannya .

Contoh Alami :
1.Karoten Jingga-Merah Wortel, Pepaya dan
lain-lain
2. Biksin Kuning seperti mentega Biji pohon Bixa
orellana
3. Karamel Coklat gelap Hidrolisis (pemecahan)
karbohidrat, gula pasir,
laktosa, dan sirup malt
4. Klorofil Hijau Daun Suji, Daun
Pandan dan dedaunan
yang berwarna hijau
5. Antosianin Merah, Jingga, Ungu dan Biru Bunga dan buah-buahan seperti BungaMawar, Pacar Air,
Kembang Sepatu,Bunga Tasbih atau Kana, Krisan,Pelargonium, Aster Cina, dan Buah Apel,Ceri, 6.
Kurkumin Kuning Kunyit
 7. Prosedur Kerja Pewarnaan

Teknik pewarnaan Gram dimulai dari pengambilan spesimen, kemudian dilanjutkan

dengan persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan slide di bawah mikroskop. Bakteri
Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal (20-80 nm), sehingga akan mengambil
kompleks stain-mordant primer dan akan tampak biru atau ungu di bawah mikroskop. Sementara
itu, bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (1-3 nm) dan persentase
ikatan silang yang rendah diikuti dengan lapisan membran luar yang tipis (7-8 nm), sehingga
tidak mengikat kompleks stain-mordant dan akan tampak merah di bawah mikroskop.[1]

Persiapan Pasien

Persiapan pasien bergantung pada jenis sampel yang diambil. Beberapa jenis sampel yang dapat
diambil antara lain sampel darah, biopsi jaringan, cairan serebrospinal, cairan sinovial, lavase
bronkoalveolar, sputum, nanah, duh tubuh, dan urin.[2,8,9]

Peralatan

Peralatan yang perlu dipersiapkan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:

 Mikroskop cahaya
 Kaca objek
 Pipet
 Api bunsen
 Kertas saring
 Inoculation loop
 Minyak imersi

Bahan-bahan yang diperlukan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:

 Sampel yang akan diperiksa

 Cairan pewarna: larutan gentian violet atau kristal violet
o Larutan A: kristal violet 2 g, etanol 95% 20 ml
o Larutan B: ammonium oksalat 0,8 g, air steril 80 mL
 Mordant larutan iodin Gram: iodin 1 g, potassium iodida 2 g, air steril 300 ml
 Zat dekolorisasi (peluntur): etanol 95% 50 ml atau aseton 50 ml
 Counterstain:
o Stock solution: safranin O 2,5 g, etanol 95% 100 ml
o Working solution: stock solution 10 ml, air steril 90 mL[1]

Prosedural
Prosedur pewarnaan Gram terdiri dari persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan di
bawah mikroskop.

Persiapan Apusan

Cara mempersiapkan apusan yang akan diwarnai adalah :

1. Sterilkan inoculating loop pada api bunsen hingga memerah, kemudian tunggu dingin
selama sekitar 30 detik. Jika loop masih panas saat spesimen diambil, sel bakteri bisa
rusak
2. Dengan menggunakan kaca objek (slide) bersih, letakkan spesimen di tengah kaca objek.
Jika spesimen diambil dari agar plate, beri 1 tetes air untuk membuat suspensi terlebih
dulu
3. Dengan menggunakan inoculating loop, apuskan spesimen di atas kaca objek sampai
didapatkan lapisan yang tipis, kemudian keringkan di udara
4. Panaskan kaca objek dengan melewatkannya di atas api bunsen sebanyak 2-3 kali agar
terfiksasi[1]

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara :

1. Tuangkan cairan pewarna kristal violet pada preparat secara merata, tunggu selama 1
menit
2. Miringkan preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
3. Tuangkan cairan mordant pada preparat, tunggu selama 1 menit
4. Miringkan kembali preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
5. Lakukan dekolorisasi dengan cara meneteskan cairan dekolorisasi sedikit demi sedikit
pada preparat hingga tidak ada zat warna yang mengalir keluar dari preparat
6. Bilas preparat dengan air mengalir
7. Tuangkan counterstain (safranin) pada preparat, tunggu selama 30 detik sampai 1 menit
8. Bilas preparat dengan air mengalir, kemudian keringkan preparat
9. Lakukan pengamatan preparat menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 kali, 400
kali, hingga 1000 kali[4,10]

Kesalahan dalam Prosedur Pewarnaan Gram

Terdapat beberapa kesalahan yang dapat terjadi saat melakukan prosedur pewarnaan gram,
antara lain:

 Pemanasan berlebihan saat fiksasi

 Preparat terlalu tebal
 Larutan kristal violet konsentrasi rendah
 Pencucian berlebihan dengan air (sebaiknya tidak lebih dari 5 detik)
  Iodin yang kurang. Semakin rendah konsentrasi iodin yang digunakan, semakin mudah
dekolorisasi terjadi
 Dekolorisasi yang terlalu lama dengan etanol
 Counterstaining terlalu banyak dan terlalu lama[2]

Interpretasi

Pada akhir prosedur pewarnaan gram, dilakukan interpretasi dari preparat. Bakteri Gram positif
akan berwarna biru atau ungu, contohnya Staphylococcus sp dan Streptococcus sp. Bakteri Gram
negatif akan berwarna merah atau merah muda, contohnya E.coli dan Salmonella typhi. Fungi
seperti Candida dan Cryptococcus dapat juga diperoleh pada pemeriksaan Gram.

Beberapa jenis bakteri memiliki sifat Gram variabel, di mana dapat terlihat campuran sel
berwarna ungu dan merah muda. Genus bakteri Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacterium,
Mycobacterium, dan Propionibacterium memiliki dinding sel yang rentan mengalami kerusakan
saat pembelahan sel, sehingga dapat memiliki tampilan Gram negatif. Bakteri Bacillus,
Butyrivibrio, dan Clostridium memiliki penurunan ketebalan peptidoglikan dalam
perkembangannya, sehingga beberapa sel akan terlihat Gram negatif.[10] Gardnella memiliki
dinding sel Gram positif yang berbeda, sehingga menyebabkan hasil pewarnaan menjadi Gram
negatif atau Gram variabel.
 DAFTAR PUSTAKA

https://farmalkes.kemkes.go.id/ufaqs/apa-itu-sediaan-farmasi/
https://paralegal.id/pengertian/sediaan-farmasi/
https://www.kompas.com/skola/read/2021/06/29/160000569/sediaan-larutan--pengertian-jenis-dan-zat-
tambahannya?page=all
http://repository.wima.ac.id/id/eprint/6897/2/BAB%201.pdf
https://wira.co.id/sediaan-farmasi/
https://eprints.umm.ac.id/26701/2/jiptummpp-gdl-fitrohnill-33096-2-babi.pdf
https://www.academia.edu/43091965/
LAPORAN_PRAKTIKUM_MIKROBIOLOGI_PEMBUATAN_PREPARAT_DAN_PEWARNAAN_B
AKTERI
http://repository.poltekkes-kdi.ac.id/1882/2/2.%20BAB%20I.pdf
https://www.academia.edu/10414811/
Pewarnaan_Bakteri_1_MAKALAH_PEWARNAAN_SEDERHANA_NEGATIF_KAPSUL_dan_GRAM
https://eprints.umm.ac.id/39134/3/BAB%20II.pdf
https://www.infolabmed.com/2018/09/faktor-faktor-yang-mempengaruhi.html
C:\Users\win10\Downloads\371256702-Sediaan-Dan-Pewarnaan.ppt
https://www.academia.edu/9066333/Teknik_Pewarnaan