PEWARNAAN SPORA

MK. MIKROBIOLOGI

Disusun Oleh

Nama NIM
Dita Permata Sari P17331120424
Fina Afina Septiani P17331120428
Weny Anggraini P17331120463

Dosen Pengampu : Ir. Agus Sulaeman, M.Kes

KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN BANDUNG
JURUSAN GIZI PROGRAM STUDI GIZI DAN DIETETIKA
PROGRAM SARJANA TERAPAN
2021
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur atas kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa, karena, atas berkat
dan kehendak-Nyalah, sehingga penulis masih diberi kesempatan untuk
menyelesaikan tugas makalah ini. Tidak lupa pula penulis mengucapkan terima kasih
banyak kepada Ir. Agus Sulaeman, M.Kes yang selaku dosen pengampu yang telah
memberikan kesempatan kepada penulis untuk membuat sebuah makalah yang
berkaitan dengan topik yang telah ditentukan.
Makalah yang penulis bahas dan kembangkan adalah “Pewarnaan Spora”.
Penulis menyadari bahwa dalam pembuatan tugas makalah ini banyak memiliki
kekurangan dan masih sangat jauh dari kesempurnaan, maka dari pada itu penulis
memohon maaf dan sangat meminta kritik dan saran yang membangun dari dosen
pengampu sehingga nantinya makalah ini dapat bermanfaat bagi kita semua. Aamin.

Bandung, 18 Maret 2021

Penulis

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR..................................................................................................i
DAFTAR ISI................................................................................................................ii
BAB I PENDAHULUAN............................................................................................1
1.1. Latar Belakang.......................................................................................................1
1.2. Maksud dan Tujuan...............................................................................................2
1.3. Prinsip Percobaan..................................................................................................2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................3
2.1. Teori Umum............................................................................................................3
2.2. Bacillus....................................................................................................................3
2.3. Ketahanan Spora Bacillus di Lingkungan............................................................4
BAB III METODOLOGI............................................................................................6
3.1. Alat dan Bahan.......................................................................................................6
3.2. Prosedur Kerja.......................................................................................................6
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................................9
4.1. Hasil Pengamatan...................................................................................................9
4.2. Pembahasan............................................................................................................9
BAB V PENUTUP.....................................................................................................13
5.1. Kesimpulan...........................................................................................................13
5.2. Saran.....................................................................................................................13
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................iii

ii
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroba atau
mikroorganisme. Karena ukurannya yang sangat kecil dan sukar dilihat oleh
mata biasa, maka mikroba hanya dapat dilihat menggunakan mikroskop.
(Sumarsih, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup merupakan hal
yang sangat sulit, selain karena bakteri tidak berwarna, bakteri juga
transparan dan kecil. Bakteri yang hidup akan kontras dengan air dimana sel-
sel tersebut disuspensikan. Untuk mengatasi hal tersebut, maka
dikembangkan sebuah teknik pewarnaan bakteri, sehingga sel mudah diamati.
Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba dengan teknik
pewarnaan, dapat digunakan dua cara, yaitu mengamati sel mikroba yang
masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati mikroba yang telah mati dengan
diwarnai. Namun, yang paling banyak digunakan adalah mengamati mikroba
dengan diwarnai. Maka dari itu, teknik pewarnaan mikroba menjadi cara
utama yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi pada umumnya.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spiral, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan mewarnai menggunakan zat pewarna.
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan berkembangnya
teknik pewarnaan bakteri. Zat warna akan mengadsorbsi dan membiaskan
cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur pada mikroba

1
 yang diamati. Terdapat juga beberapa faktor pewarnaan yang akan dipelajari
dan dilakukan dalam praktikum kali ini. (Dwidjoseputro, 1994)
Pada praktikum kali ini, digunakan bakteri Bacillus sp untuk
pengamatan dengan empat teknik pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana,
pewarnaan gram, pewarnaan negatif dan pewarnaan spora.

1.2. Maksud dan Tujuan

1. Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami metode pewarnaan spora.
2. Mampu mengidentifikasi bakteri Bacillus dengan menggunakan metode
pewarnaan spora.

1.3. Prinsip Percobaan

Pewarnaan Spora : Metode pewarnaan spora berfungsi untuk
mempermudah pengamatan agar peneliti atau pengamat mampu melihat spora,
membedakan dengan sel vegetative ataupun mengamati bentuknya. Endospora
tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Hal tersebut yang
menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit.

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Teori Umum

Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus
Bacillus dan genus Clostridium. Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh
vegetative bakteri disebut sebagai endospora (endo:dalam, spora:spora) yaitu
spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa
endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang
mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan. (Aditya,
2010).
Dalam pewarnaan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat
menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksud tersebut
adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit dan untuk memperjelas
pengamatan, sel vegetatif juga diwarnai dengan larutan safranin sehingga sel
vegetatif ini berwarna merah, sedangkan spora berwarna hijau. Dengan
demikian, ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam
tubuh sel vegetatif juga dapat diidentifikasi. (Volk dan Wheeler, 1988).
Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri.
Letak spora ada tiga macam, yaitu sentral (letak spora berada ditengah- tengah
sel), terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal (letak spora
diantara ujung-ujung dan ditengah-tengah terminal) (Dwidjoseputro, 2005).

2.2. Bacillus
Bacillus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, beberapa
spesies bersifat aerob obligat dan bersifat anaerobik fakultatif, dan memiliki
endospora sebagai struktur bertahan saat kondisi lingkungan tidak mendukung

3
 (Backman et al.,1994). Menurut Fardiaz (1992) bentuk spora (endospora)
Bacillus bervariasi bergantung pada spesiesnya. Endospora ada yang lebih kecil
dan ada juga yang lebih besar dari pada diameter sel induknya. Pada umumnya
sporulasi terjadi bila keadaan medium memburuk, zat-zat yang timbul sebagai
pertukaran zat yang terakumulasi dan faktor luar lainnya yang merugikan.
Bacillus mempunyai sifat yang lebih menguntungkan daripada
mikroorganisme lain karena dapat bertahan hidup dalam waktu yang lama pada
kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk pertumbuhannya (Wong,
1994). Spesies dari jenis Bacillus juga berbeda dalam sifat pertumbuhannya.
Beberapa bersifat mesofilik misalnya Bacillus subtilis yang lainnya bersifat
termofilik fakultatif misalnya Bacillus coagulans atau termofilik pada Bacillus
stearothermophilus sering menyebabkan kerusakan pada makanan kaleng.
Sebanyak 22 spesies Bacillus telah diidentifikasi diantaranya banyak ditemukan
pada makanan. Beberapa kelompok bakteri ini menghasilkan metabolit
sekunder yang dapat menekan pertumbuhan patogen (Backman et al.,1994).
Bacillus telah banyak diaplikasikan pada benih untuk mencegah patogen tular
tanah seperti Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Botrytis cinera,
Phytium sp. dan Sclerotium rolfsii (Baker & Cook, 1974).

2.3. Ketahanan Spora Bacillus di Lingkungan

Menurut Gaman & Sherrington (1981), spora merupakan “ body “ yang
kuat dan keras terbentuk pada beberapa jenis bakteri. Waluyo (2007) ada dua
tipe spora yang terbentuk, pertama terbentuk di dalam sel disebut dengan
endospora dan di luar sel disebut dengan eksospora. Irianto (2006) resistensi
endospora terhadap panas disebabkan oleh kadar air yang dikandungnya dan
pembungkus spora yang tebal. Waluyo (2007) endospora masih dapat bertahan
pada suhu air mendidih selama 20 jam.

4
 Naufalin (1999) mekanisme ketahanan spora terhadap panas adalah
senyawa peptidoglikan yang merupakan penyusun korteks dengan struktur
ikatan silang dan bersifat elektronegatif, berperan dalam meningkatkan
ketahanan spora terhadap panas dengan cara mengontrol kandungan air di
dalam protoplas yaitu mempertahankan kadar air yang rendah. Beberapa faktor
yang ikut mempengaruhi sifat polimer peptidoglikan juga ikut berperan
menurunkan ketahanan spora terhadap panas, misalnya adanya asam dan
beberapa kation multivalent.
Salamah (2002) melaporkan pembentukan spora Bacillus thuringiensis
subsp. Israelensis dimulai pada jam ke-9 dimungkinkan karena kondisi
lingkungan yang kurang sesuai bagi sel yaitu pH ekstrim. (Lay, 1994)
mikroorganisme memiliki enzim yang berfungsi sempurna pada pH tertentu.
Bila terjadi perubahan pH, pertumbuhan dan metabolisme mikroorganisme
dapat berhenti. Waluyo (2007) bakteri dalam bentuk spora lebih tahan terhadap
kekeringan, panas, asam dan dingin karena dinding spora lebih bersifat
impermeabel dan spora mengandung sedikit air

5
 BAB III

METODOLOGI

3.1. Alat dan Bahan

No. Nama Alat Jumlah Nama Bahan Konsentrasi Jumlah
1. Bak pewarna 1 buah Biakan murni - -
Bacillus
2. Bunsen 1 buah Aquades - -
3. Kawat ose 1 buah Tinta cina - -
4. Kaca preparat 1 buah Malachite green - -
5. Gegep 1 buah Air suling - -
6. Mikroskop 1 buah Safranin - -
7. - - Minyak imersi - -

3.2. Prosedur Kerja

No. Cara Kerja Gambar
1. Sterilisasi kaca preparat yang
sebelumnya telah ditetesi aquades,
kaca preparat dijepit dengan
gegep. Sterilisasi dengan
mengangin-anginkan kaca preparat
diatas api bunsen.

6
2. Sterilisasi kawat ose dengan
membakar ujung kawat yang
berbentuk lingkaran hingga kawat
membara. Kemudian
anginanginkan.

3. Mengoleskan mikroba ke kaca

preparat menggunakan kawat.

4. Meneteskan 1-2 tetes malachite

green, diamkan selama 1 menit.
Kemudian melakukan fiksasi.

5. Mencuci dengan air suling selama

30 detik, kemudian melakukan
fiksasi.

7
6. Menambahkan safranin, kemudian
diamkan 30 detik.

7. Mencuci dengan air suling selama

30 detik, kemudian melakukan
fiksasi.

8. Menambahkan minyak imersi,

kemudian melakukan pengamatan.

8
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Hasil pengamatan yang didapat pada praktikum pewarnaan spora adalah :

No. Hasil Pengamatan Gambar

1. Mikroba : bacillus
Bentuk : batang
Letak spora : terminal (di ujung)

4.2. Pembahasan
Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada
pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri
dan bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan
mengembangkan lapisan luar spora sehingga berwarna hijau. Melalui
pendinginan utama akan terperangkap di dalam spora dengan pencucian zat
warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada
pewarnaan yang kedua (safranin) sel vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat
warna malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi
kedalam endospora (Dwidjoseputro, 2005).
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan
luar baik lagi bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah

9
bakteri. Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam
sel. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada
bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah, jika
selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru.
Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar,
korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus. Apabila sel vegetatif
membentuk endospora, sel ini membuat enzim baru, memproduksi dinding sel
yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata lain sporulasi adalah
bentuk sederhana diferensiasi sel, karena itu, proses ini diteliti secara mendalam
untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi.
Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam
sediaan suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna
pada sel yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus,
ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian
dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif.
Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora biasanya diwarnai
dengan hijau malachit atau carbol fuchsin.
Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong atau silindris. Berdasarkan
letaknya spora di dalam sel kuman, dikenal letak sentral, Sebenarnya jenis
letak spora ada 3 buah: sentral, yaitu letak spora berada di tengah-tengah sel;
terminal, yaitu letak spora ada diujung sel; sub terminal, yaitu letak spora
diantara ujung dan di tengah-tengah sel. Ada spora yang garis tengahnya lebih
besar dari garis tengah sel kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel
kuman.
Beberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora
dihasilkan di dalam tubuh vegetatif bakteri tersebut, spora merupakan tubuh
bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi, dihasilkan pada faselanjut
dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif.

10
Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi , bahawa ada dua
genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan
genus Clostridium.Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh vegetative
bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora
yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa
endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang
mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan.
Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut
dapat bertahan pada kondisi yang ekstrim. Bakteri yang dapat membentuk
endospore ini dapat hidup dan mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan
sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis protoplasma
baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.
Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri
diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora.
dengan menggunakan zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam
proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan
bersamaan dengan zat warna tersebut sehingga memudahkan zat warna tersebut
untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.
Pada percobaan ini digunakan larutan malachite green dan safranin.
Larutan malachite green yang berwarna hijau dan larutan safranin yang
berwarna kemerahan akan diserap oleh bakteri sehingga pengamatan menjadi
lebih mudah. Dalam pengamatan, terdapat warna kehijauan yang terletak di
ujung bakteri dan warna kemerahan yang terletak diantaranya. Warna kehijauan
ini lah yang dinamakan spora, sedangkan warna kemerahannya adalah sel
vegetatif dari bakteri. Saat menggunakan lensa objektif pengamat harus
mengoleskan minyak emersi ke bagian objek, minyak emersi ini berfungsi
sebagai pelumas dan untuk memperjelas bayangan benda sehingga mencegah
proses terjadinya pembiasan cahaya, karena saat perbesaran 100 kali, letak

11
lensa dengan objek yang diamati sangat dekat, bahkan kadang bersentuhan.
Hasil pengamatan dari percobaan ini menunjukkan bahwa letak spora pada
bakteri bacillus adalah terminal (di ujung).
Dalam prosedur terdapat fiksasi, Fiksasi adalah proses pengawetan dan
pelekatan atau penempelan struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi.
Selain itu fiksasi juga berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga
bakteri tidak mengalami lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi
dilakukan setelah olesan pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum
kering akan menyebabkan sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi
tidak beraturan bentuknya. Tujuan dari fiksasi adalah pelekatan bakteri supaya
pada saat pencucian, bakteri tersebut tidak ikut hilang tercuci.
Fiksasi yang digunakan pada praktikum kali ini adalah fiksasi panas,
yaitu dengan cara melewatkan kaca preparat di atas api. Fiksasi dilakukan
sampai kaca preparat terasa hangat apabila ditempelkan pada punggung tangan.
Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan lama, karena bakteri yang
ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi perubahan bentuk dan
penyusutan sel. Setelah selesai fiksasi diamkan terlebih dahulu sampai suhunya
menurun, tidak boleh melakukan pewarnaan dalam keadaan panas, jika masih
dalam keadaan panas struktur sel akan hancur dan tidak akan terlihat di bawah
mikroskop. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pengecatan spora yaitu
fiksasi, waktu pengecatan tidak tepat, smear terlalu tebal, konsentrasi reagen,
umur bakteri, dan nutrisi.

12
 BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan
Dari praktikum pewarnaan spora kali ini dilakukan pada bakteri Bacillus.
Hasil pengamatan dari percobaan ini menunjukkan bahwa letak spora pada
bakteri Bacillus adalah terminal (di ujung) pada perbesaran mikroskop hingga
100x. Dalam pengamatan, terdapat warna kehijauan yang terletak di ujung
bakteri dan warna kemerahan yang terletak diantaranya. Warna kehijauan ini
lah yang dinamakan spora, sedangkan warna kemerahannya adalah sel vegetatif
dari bakteri. Saat akan melakukan pewarnaan, tidak boleh dalam keadaan
panas, jika masih dalam keadaan panas struktur sel akan hancur dan tidak akan
terlihat di bawah mikroskop, karena sel peka sekali terhadap panas.

5.2. Saran
Sebaiknya pada praktikum selanjutnya lebih berhati-hati dan teliti pada
saat pengerjaan dan diharapkan untuk menjaga kebersihan lingkungan sekitar.
Baik alat maupun benda yang kita gunakan untuk praktikum dan benda yang
kita gunakan di tubuh kita. Selain itu diharapkan praktikan lebih berhati-hati
saat pengamatan dengan mikroskop sehingga preparat tidak pecah atau rusak
karena jarak antara lensa terlalu dekat dengan preparat. Kerjasama antar
praktikan dan pengawas juga lebih ditingkatkan lagi agar praktikum berjalan
dengan lancar.

13
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Gramedia

Hadiutomo, Ratna S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia

Pustaka Utama : Jakarta.

Lay,W.B.1994.Analisa Mikroba di Laboratorium.EdisiI.Jakarta : PT.Raja Grafindo

Persada

Pelczar,Michael J. ECS. Chan. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta. UI Press

Volk and Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga

Najreen, M. 2015. Pewarnaan Spora. LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI.

Farmasi, Universitas Padjajaran. Diakses dari
https://www.academia.edu/11685936/pewarnaan_spora

Nadifameidita, F., Q. 2016. TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI. LAPORAN

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN. FAKULTAS
TEKNIK DAN ILMU KOMPUTER, Teknik Lingkungan. Universitas Bakrie.
Diakses dari https://pdfcoffee.com/laporan-teknik-pewarnaan-mikroba-pdf-
free.html

Devi, H., S. 2014. VIABILITAS Bacillus sp. BK17 PADA BERBAGAI BAHAN
PEMBAWA. Skripsi. FMIPA, Departemen Biologi, Universitas Sumatera
Utara. Diakses dari
http://repository.usu.ac.id/bitstream/handle/123456789/40713/Chapter
%20II.pdf?sequence=12&isAllowed=y

iii
iv