LAPORAN PRAKTIKUM

PENGANTAR BAKTERIOLOGI TUMBUHAN

“Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan Spora Bakteri”

OLEH:
NAMA : FILIEN
NIM : D1F121020
KELAS : PTP-B
ASISTEN : MUHAMMAD SYAHRUL

JURUSAN/PROGRAM STUDI PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2022
 I. PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Pewarnaan Gram adalah prosedur pewarnaan diferensial yang dapat

membedakan jenis bakteri berdasarkan reaksi yang timbul pada struktur dinding

sel selama prosedur pewarnaan. Pewarnaan Gram dapat bermanfaat untuk

mengidentifikasi spesies bakteri pada berbagai penyakit infeksi seperti

pneumonia, tonsilitis bakterial, meningitis, dan gonorrhea. Pewarnaan Gram

pertama kali digunakan pada tahun 1884, oleh ahli patologi Hans Christian Gram,

yang ingin mencari cara visualisasi bakteri kokus dari jaringan paru orang yang

meninggal akibat pneumonia. Pewarnaan ini menggunakan gentian violet sebagai

zat pewarna, iodin sebagai mordant, dan etanol untuk peluntur.

Pemeriksan Gram diindikasikan untuk memperoleh karakteristik dan

klasifikasi bakteri yang berasal dari spesimen, yang akan digunakan untuk

pengambilan keputusan klinis lebih lanjut. Bakteri Gram positif memiliki lapisan

peptidoglikan tebal sehingga akan berwarna biru sampai ungu. Sedangkan bakteri

Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan tipis sehingga akan berwarna merah

sampai merah muda. Pewarnaan Gram tidak memiliki kontraindikasi dan

komplikasi yang spesifik. Kontraindikasi lebih berkaitan dengan kontraindikasi

proses pengambilan specimen. Prosedur pewarnaan gram dapat membantu

mengidentifikasi organisme penyebab penyakit.

Tes string kalium hidroksida (KOH) digunakan untuk membedakan isolat

bakteri. Lingkaran pertumbuhan dari koloni bakteri bercampur dalam suspensi 3%

KOH berair pada kaca slide. Tes ini dianggap positif jika suspensi seperti gel atau
menjadi kental dan keluar ketika loop diangkat, maka isolat adalah gram negatif..

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan yang tidak dapat di warnai

dengan pewarnaan biasa, diperlukan tekhnik pewarnaan khusus. Endospora tidak

mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai, zat

warna tersebut akan sulit hilang.

Berdasarkan latar belakang di atas, maka perlu dilakukan praktikum tenang

“Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan Spora Bakteri”.

I.2. Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah pada praktikum pembuatan medium biakan adalah

sebagai berikut:

1. Apa yang dimaksud dengan Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan

Spora Bakteri?

2. Apa perbedaan dari Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan Spora

Bakteri?

I.3. Tujuan dan Kegunaan

Tujuan praktikum Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan Spora Bakteri

adalah agar mahasiswa mengetahui cara Pewarnaan Gram, Uji KOH dan

Pewarnaan Spora Bakteri. Sedangkan kegunaan dari praktikum Pewarnaan Gram,

Uji KOH dan Pewarnaan Spora Bakteri adalah mahasiswa dapat mengetahui

teknik-teknik Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan Spora Bakteri.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

Metode gram dengan pengujian KOH 3% merupakan metode identifikasi

bakteri yang baik dalam menentukan jenis dominan bakteri yang aktif yang

ditandai dengan adanya lendir. Apabila bakteri yang dicampurkan terlalu sedikit

akan menimbulkan kesalahan dalam pengujian dan memungkinkan tidak bereaksi,

sehingga dalam pengujian ini penggunaan latar berwarna gelap sangat

baik (Hardiansyah et al., 2020).

Salah satu metode yang dapat mengidentifikasi suatu bakteri ialah Pewarnaan

Gram, Pewarnaan Kapsul dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram

merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak

digunakan dalam laboratorium mikrobiologi (Rahayu dan Gumilar, 2017). Bakteri

ialah penyebab utama infeksi mata luar di seluruh dunia. Pengobatan yang sesuai

dengan penyebab infeksi dapat mencegah munculnya bakteri yang resistan

terhadap antibiotik (Bulele et al., 2019).

Karakterisasi yang dilakukan melalui uji KOH yakni untuk mengetahui

karakteristik isolat patogen yang diperoleh. Dari hasil isolasi diketahui bahwa

penyebab penyakit busuk buah adalah bakteri. Isolat bakteri tersebut merupakan

bakteri Gram negatif, bersifat soft rot, anaerob fakultatif dan virulen (Oviana et

al., 2015).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk

mengelompokkan bakteri gram positif dan gram negatif. Perbedaan struktur,

komposisi didnding sel bakteri dan permeabilitas diantara kediua kelompok

dinding sel bakteri menyebabkan perbedaan warna pada bakteri gram positif dan

gram negatif. Pewarnaan gram bedasarkan kemampuan bakteri untuk menahan

pewarna primer (kristal ungu) atau kehilangan warna primer dan menerima warna

tandingan (sarfanim). Bakteri grm positif akan menunjukkan warna ungu

sedangkan untuk bakteri gram negative akan menunjukan warna merah (Jannah et

al., 2017).

Identifikasi bakteri dengan pewarnaan Gram, pewarnaan spora, identifikasi

molekuler dengan gen 16S rRNA, dan menguji infektivitas pada ikan nila. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa isolat C3.10.16 memiliki indeks proteolitik

tertinggi yaitu 2,61 dan tidak patogen terhadap ikan nila dengan tingkat

kelangsungan hidup 100% (Andriani dan Kasanah, 2018).

 III. METODE PRAKTIKUM

III.1. Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Praktikum isolasi bakteri pathogen dilakukan di laboratorium Proteksi

Tanaman, Unit Pendidikan, Fakultas Pertanian, Universitas Halu Oleo, pada

hari Selasa, tanggal 25 Oktober 2022, pukul 10:30 WITA – sampai selesai.

III.2. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu sampel tanaman sakit,

sampel tanah dari sekitr perakaran tanaman sakit, medium biakan (NBY, King’s

B, YDCA, TTC/TSB), aquadest steril, dan alcohol 70%, sarfanim, crystal violet,

mordan lugol iodine.

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah jarum ose, lampu bunsen,

mikroskop, dan pipet tetes.

III.3. Prosedur Praktikum

III.3.1. Pewarnaan Gram

Langkah-langkah pewarnaan gram adalah sebagai berikut: pertama bersihkan gelas

objek dengan alcohol 70% hingga bebas lemak, kemudian lewatkan diatas api Bunsen.

Kedua, ambil koloni bakteri Bacillus dan letakkan pada gelas objek kemudian kering-

anginkan, kemudian lewatkan diatas bunsen untuk menfiksasi bakteri. Ketiga, bubuhkan

cat crystal violet sebanyak 2-3 tetes diamkan selama 1 menit, kering anginkan dnegan

tissue bersih tekan perlahan-lahan, dan jangn digosok.

 Keempat, tetesi dengan larutan morgan lugol dan biarkan selama 1 menit, dan cuci.

Kelima, cuci dengan dekolorizer selama kurang lebih 30 detik, cuci dengan air mengalir

dan kering-anginkan. Keenam, beri larutan counterstain diamkan selama 2 menit, cuci

dengan air mengalir dan kering-anginkan. Ketujuh, amati preparate dengan mikroskop.

Kedelapan, gambar hasil pengamatan dan beri keteranngan bentuk sel, warna dan reaksi

pengecatan (bakteri gram positif berwarna violet, sedangkan gram negatif berwarna

merah).

III.3.2. Uji Larutan KOH

Berdasarkan praktikum ini adapun langkah-langkah pengujian KOH, yang

dilakukan adalah sebagai berikut: Pertama, ambil satu ose biakan bakteri uji dan

campurkan dengan dua tetes larutan KOH 3%, diatas gelas objek. Kedua, aduk secara

merrata dengan jarum ose, Tarik jarum ose keatas gelas objek dan amati pembentukan

lender (jika terbentuk lendir berarti bakteri bergram negatif, sedangkan jika tidak

berlendir berarti bergram positif).

III.3.3. Pewarnaan Spora

Untuk pewarnaan spora bakteri, langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai

berikut: Pertama, koloni yang tumbuh pada media agar diambil dan disuspensikan di

dalam satu tetes aquadest steril di atas gelas objek. Kedua celupkan gelas objek selama 10

menit kedalam larutan alkohol. Ketiga, cuci dengan air mengalir dan kering-anginkan

(tekan perlahan dengan menekan-nekannya dengan kertas tissue hingga kering).

Keempat, celupkan gelas objek kedalam larutan encer sarfanim 0,05% (w/v) selama 15

menit. Kelima, bilas gelas objek dengan air bersih dan kering-anginkan. Keenam, amati

sel bakteri di bawah mikroskop dengan peresaran 40x (sel bakteri berwarna merah, dan

spora berwarna hijau).

 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1. Hasil

Adapun hasil dari pengamatan Pengujian KOH dan pewarnaan Gram spora

bakteri dapat dilihat pada gambar di bawah ini:

a b c
 Gambar 4.1.1. Pengujian KOH 3%; (a). TSA sampel tanah, (b).
YDCA sampel padi, (c). Kings’B sampel kentang.

Gambar 4.1.2. Pewarnaan Gram spora bakteri; (a). YDCA sampel

padi, (b). TSA sampel tanah, (c). Kings’B sampel
kentang

IV.2.

V. PENUTUP

a b c
 DAFTAR PUSTAKA
Hardiansyah MY, Yunus M, Jaya MA. 2020. Identifikasi Plant Growth
Promoting Rhizobacteria pada Rizosfer Bambu Duri dengan Gram KOH
3%. Jurnal Agrotech Res. 4(1): 1-5.
Rahayu SA, Gumilar MH. 2017. Uji Cemaran Air Minum Masyarakat Sekitar
Margahayu Raya Bandung Dengan Identifikasi Bakteri Escherichia coli.
Bulele T, Rares FES, Porotu'o J. 2019. Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan
Gram pada Penderita Infeksi Mata Luar di Rumah Sakit Mata
Kota Manado. Jurnal Bioedit. 7(1):30-36.
Oviana T, Aeny TN, Prasetyo T. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Penyebab
Penyakit Busuk Buah pada Tanaman Nanas (Ananas comosus L.). Jurnal
Agrotek Tropika. 3(2):220-225.
Jannah R, Safika, Jalaludin M, Darmawi, Farida, Aliza D. 2017. Jumlah Koloni
bekteri selulolitik pada sekum ayam kampung. Jurnal Ilmiah Mahasiswa.
01(03):558-565.
Andriani S, Kasanah N. 2018. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Proteolitik Tanah
Hutan Bakau dari Palembang, Rembang, Cilacap dan Situbondo. Jurnal
Aquakultur. 5(3):13-16.