LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR
“Pengecetan Gram dan Pengujian KOH pada Bakteri”

OLEH:

                `     NAMA : ANDINI AULIAH

                               NIM : D1F121012                      
 KELAS : PTP-B
ASISTEN : MUHAMMAD ILHAM, S.P.

JURUSAN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
2021
 I. PENDAHULUAN

1.1.  Latar Belakang

Mikroba dapat kita jumpai pada saat pada seluruh lingkungan baik

lingkungan normal maupun ekstrim. Setiap mikroba membutuhkan kondisi

lingkungan tertentu terkait dengan karakter morfologi dan biokimia yang

dimilikinya. Oleh karena itu, lingkungan hidup suatu mikroba akan berbeda-beda

dan adakalanya hanya spesifik untuk mikroba tertentu. Suatu lingkungan tidak

dapat dihindari bahwa mikroba akan selalu berinteraksi dengan organisme lain

baik dengan kelompoknya sendiri maupun kelompok lain.

Bakteri  mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri

merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik

bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air.

Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit. Untuk

mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri.

Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi  bakteri.

Pewarnaan Gram atau metode Gram merupakan salah satu teknik

pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi

bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-

larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan

pemucat) dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air

fuchsin.
 Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu

pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan

anggota- anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan

perbedaan dinding selnya. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang lebih

sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri

Gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural

lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel Gram-negatif

mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid.

Diantara bakteri patogen yang menyebabkan penyakit spesies gram-negatif lebih

berbahaya dibandingkan spesies Gram-positif.

Pengecetan Gram dan pengujian KOH pada bakteri ini salah satunya yaitu

untuk mempelajari teknik pengujian KOH 3%  pada bakteri. Metode KOH

umumnya menghasilkan hasil yang sama dengan metode pewarnaan Gram tapi

metode KOH tidak dapat menentukan sifat gram variabel. Gram variabel dalam

pewarnaan Gram ditampakkan dengan beberapa sel berwarna ungu dan lainnya

merah jingga. Bakteri Gram variabel yang diuji dengan KOH dapat menghasilkan

Gram (+) atau (–) seperti kelompok Coryneform (Corynebacterium, Arthrobacter

dan lain-lain).

Berdasarkan uraian di atas maka penting adanya pelaksanaan praktikum

tentang pengecetan Gram dan pengujian KOH pada bakteri untuk

mengidentifikasi dan mengetahui morfologi dari bakteri, terutama pada bakteri

Gram positif dan Gram negatif, dengan cara pewarnaan Gram dan pengujian

KOH.
1.2. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melihat bentuk bakteri dan

mempelajari cara pewarnaan.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri merupakan mikroorgansme bersel tunggal dengan ukuran Panjang.

Karakteristik bakteri dilihat dari bentuknya, seperti bulat (cocci), batang (spirilli),

koma (vibrias). Tambahan struktur bakteri yang terpenting diketahui cambuk

(flagella), kapsul (capsule) dan endospora (endospore) Flagella merupakan

struktur tambahan diluar sel yang berbentuk cabu halus yang tidak terlihat di

bawah mikroskop kecuali menggunakan teknik pewarnaan khusus susunan

flagella pada sel yang untuk diidentifikasi dan dikelompokkan menjadi dua

golongan yaitu flagella peitrichouse dan flagella polar (Arisandi, 2017). Salah

satu cara yang dapat dilakukan untuk mengetahui jenis gram dari bakteri

dilakukan pengecatan gram dimana bakteri gram negatif akan berwarna merah

kuning sampai kejinggaan setelah dilakukan proses pengecatan sedangkan bakteri

gram positif akan berwarna ungu (Murti dan Sri, 2017).

Langkah yang digunakan dalam pengecatan gram yaitu dimulai dari

pengambilan biakan bakteri dari hasil goresan dan kemudian diletakkan diatas

kaca preparat yang terlebih dahulu telah ditetesi dengan aquades steril.

Selanjutnya difiksasi di atas api bunsen kemudian ditetesi dengan zat warna kristal

violet sebagai cat dasar selama 2 menit kemudian preparat di bilas menggunakan

air mengalir. Setelah itu ditetesi dengan larutan lugol sebagai zat penguat

kemudian ditunggu selama 1 menit kemudian dibilas dengan air mengalir.

Kemudian ditetesi etanol dengan sebagai cat peluntur dan didiamkan selama 15

detik kemudian dibilas dengan air mengalir titik setelah itu ditetesi dengan air
sebagai cat penutup kemudian dibiarkan selama 1 menit dan bilas menggunakan

air mengalir selanjutnya preparat dikeringkan udara kemudian setelah preparat

kering preparat ditetesi dengan immersion oil agar preparat yang diamati dibawah

mikroskop lebih terang dengan perbesaran 100x (Juwaidin, 2018).

Bakteri Gram positif ditandai dengan sel warna ungu sedangkan gram

negatif berwarna merah atau jingga, Gram bakteri juga tifikasi dengan ada

tidaknya lendir saat ditetesi KOH 3% di titik identifikasi bakteri antagonis

merupakan spesies sama jika kemiripan kurang lebih >99% mempunyai kesamaan

genus jika kemiripan lebih besar dari >95%-<99%, dan kesamaan famili jika

kemiripan <95% (Prabawati et al., 2019).

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel

bakteri sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna

dan penambahan larutan pencuci ini digunakan sebagai histologi noda dalam

metode Gram klasifikasi bakteri titik sedangkan pemberian iodium bertujuan

untuk memperkuat warna pada bakteri titik alkohol berfungsi sebagai pemutus cat

atau peluntur warna pada bakteri titik safranin adalah noda biologis yang

digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai kontestan

dalam beberapa protokol pewarnaan pada bakteri preparat menunjukkan warna

ungu yang berarti adalah bakteri Gram positif karena kan pada bakteri tersebut

mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan safranin (Febrianti et

al., 2019).

Pengujian KOH pada bakteri juga untuk mengetahui jenis bakteri

tergolong bakteri Gram positif atau negatif dapat dilakukan dengan

mencampurkan bakteri dengan larutan KOH dan akan di ketahui perbedaan yang

mendasar antara bakteri Gram positif dan negatif yaitu apabila terbentuk lendir,

maka menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Gram negatif,

sedangkan apabila tidak terbentuk lendir maka bakteri tersebut tergolong dalam

bakteri Gram positif (Hadiotomo, 2010).

Pengujian reaksi dengan KOH yakni biakan murni bakteri antagonis yang

berumur 24 jam disuspensikan di atas gelas objek yang sebelumnya telah ditetesi

dengan KOH 3%, kemudian diaduk menggunakan jarum ose. Suspensi bakteri

yang membentuk lendir menunjukkan bakteri termasuk Gram negatif. Apabila

suspensi tidak terangkat dengan jarum ose atau encer ke menunjukkan bakteri

Gram positif (Arrianti, 2019).

 III. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Proteksi Tanaman Unit

Pendidikan Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo, pada hari Kamis, 2

Desember 2021, pukul 13:00 WITA sampai selesai.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah lampu Bunsen, jarum ose,

kaca preparate dan pipet tetes. Bahan yang digunakan adalah biakan murni dan

larutan KOH 3%

3.3. Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada praktikum ini adalah:

1. Menngambil satu ose biakan bakteri dan campurkan dengan satu larutan KOH

3%, diatas kaca preparat.

2. Mengaduk secara merata dengan jarum ose, Menarik jarum ose keatas kaca

objek dan amati pembentukan lendir Apabila berlendir mengindikasikan

bakteri Gram nrgatif, jika tidak berlendir mengindikasikan bakteri Gram-

positif.

3. Melakukan hal yang sama (prosedur 1 dan 2) untuk isolate-isolat bakteri yang

lainnya.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Hasil dari praktikum ini dapat dilihat pada gambar sebagai berikut:

4.1.1. Pengujian KOH 3% pada tanah

Gambar 1 : a. Isolat tanah

4.1.2. Pengujian KOH 3% pada jeruk

a b
Gambar 2 : a. Isolat jeruk 1, b. Isolasi jeruk 2

4.1.3. Pengujian KOH 3% pada padi

 a b
Gambar 3 : a. Isolat padi TSA dan b. Isolat padi PDA

Hasil pengujian KOH 3% dapat lihat pada tabe berikut ini:

No Kode Isolat Reaksi Gram Keterangan

.
1. Isolat tanah Gram-negatif Berlendir
2. Isolat jeruk 1 Gram-positif Tidak berlendir
3. Isolat jeruk 2 Gram-negatif Berlendir
4. Isolat padi TSA Gram-negatif Berlendir
5. Isolat padi PDA Gram-negatif Berlendir

4.2. Pembahasan

Gram suatu bakteri dapat ditentukan dengan melakukan uji KOH, jika

suspensi (campuran bakteri dengan KOH) menjadi berlendir maka dinyatakan

sebagai gram negatif,  jika tidak tampak seperti lendir maka dinyatakan sebagai

gram positif. Berdasarkan hasil pengamatan diatas terlihat isolate bakteri pada

tanah menghasilkan reaksi Gram negatif yaitu berlendir, Isolat jeruk TSA

menghasilkan Gram positif atau tidak berlendir, Isolat jeruk PDA menghasilkan

Gram negatif atau berlendir, sedangkan hasil isolate padi TSA menghasilkan

Gram negatif yaitu berlendir dan isolate padi PDA menghasilkan Gram negatif

yaitu berlendir.

Pada umumnya jarang atau tidak terjadi kebingungan dalam memutuskan

adanya lendir atau tidak meskipun beberapa kultur bereaksi secara lambat. Namun

jika bakteri yang dicampur terlalu sedikit, dikhawatirkan hasilnya akan salah.

Lebih baik pada saat melakukan uji ini menggunakan latar belakang warna hitam.

Metode
ini tidak disarankan pada kultur yang berusia beberapa minggu. Dari uraian

tersebut, dapat dinyatakan bahawa penentuan sifat gram dengan KOH 3%

(disebut KOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram.

Secara teoretis gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang

tipis sedangkan gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di

ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat

sel gram (-) pecah. Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang

merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat

panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat berarti

lengket) yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum

inokulum.

Bakteri Gram positif  adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna

violet dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Contoh bakteri Gram

positif, yaitu Actinomyces, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium,

Bifidobacterium, Arachnia, Clostridium, Peptostreptococcus, dan Staphylococcus.

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna merah,

dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Lapisan peptidoglikan pada bakteri

Gram negatif terletak di ruang periplasmik antara membran plasma dengan

membran luar. Contoh bakteri Gram negatif, yaitu Azotobacter, Rhizobium

leguminosarum, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella typhi, dan Helicobacter pylori.

 V. PENUTUP

5.1.  Kesimpulan

Penentuan bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat dilakukan dengan

pengecatan Gram dan Pengujian KOH. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang

dinding selnya menyerap warna violet dan memiliki lapisan peptidoglikan yang

tebal. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna

merah, dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Lapisan peptidoglikan pada

bakteri Gram negatif terletak di ruang periplasmik antara membran plasma dengan

membran luar. Berdasarkan hasil pengamatan diatas terlihat isolate bakteri pada

tanah menghasilkan reaksi Gram negatif yaitu berlendir, Isolat jeruk TSA

menghasilkan Gram positif atau tidak berlendir, Isolat jeruk PDA menghasilkan

Gram negatif atau berlendir, sedangkan hasil isolate padi TSA menghasilkan

Gram negatif yaitu berlendir dan isolate padi PDA menghasilkan Gram negatif

yaitu berlendir.

5.2.  Saran

Pada praktikum ini banyak prosedur yang harus dilakukan secara teliti dan

tepat, sehingga disarankan agar setiap perlakuan dilakukan sesuai prosedur dan

aturan- aturan agar hasil pengamatan sesuai dengan yang diharapkan.

 DAFTAR PUSTAKA

Arisandi A, Badrud T, Raini Y. 2017 Jumlah Koloni pada Media Kultur Bakteri
yang Berasal dari Thallus dan Perairan Senta Budidaya Kappaphycus
Alvarezii di Sumenep. Jurnal Perikanan dan Kelautan. 9(1): 57-64.

Arriani IF, Luqman QA, Restu RK. 2019. Pemanfaatan Bakteri Antagonis
Lumpur Sidoarjo untuk Menekan Sclerotium Rolfsii Sacc. Penyebab
Penyakit Rebah Semai pada Tanaman Kedelai, Jurnal Viabel Pertanian.
13(1): 11=20.

Febrianti DR, Eka K, Via O. 2019. Potensi Kombinasi Ekstrak Daun Belimbing
Wuluh (Averrthoa bilimbi L.) Dengan Amoksisilin Terhadap
Staphylococcus Aureus. Borneo Journal OF Phamascientech. 3(1): 94-
100.

Hadiotomo, Ratna S. 2010. Praktikum Mikrobiologi Dasar. Jakarta. Gramedia.

Juwaidin. 2018. Uji Potensi Bakteri Bacillis Amyloliquefaciens Subsp. Plantarum

Sebagai Kandidat Probiotik Pada Unggas. Skripsi. Fakultas Peternakan,
Universitas Mataram. Mataram.

Murti NIK dan Ni Nyoman Sri B. 2017. Prevalensi Salmonella Sp. Pada Cilok di
Sekolah Dasar di Denpasar. E-Jurnal Medika. 6(5): 30-41.

Prabawati A, Ari S, Sugiarto. 2019. Bakteri Filosfer Padi sebagai Kandidat Agen
Biocontrol terhadap Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo) Penyebab
Penyakit Hawar Daun Bakteri.