LAPORAN PRAKTIKUM

PENGANTAR BAKTERIOLOGI TUMBUHAN

“Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan Spora Bakteri”

Oleh :
NAMA : YOVIE NATANIEL
NIM : D1F121005
KELAS : PTP-A
ASISTEN : ANDI HIQMAWATI AF., S.P.

JURUSAN / PROGRAM STUDI PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2022
 I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat jenis larutan, yaitu larutan zat

warna basa, mordant, pencuci zat warna, dan satu zat warna lainnya (counterstain)

yang berbeda dari zat warna yang pertama. Mordant adalah suatu zat yang dapat

menaikkan afinitas atau pengikatan antara sel dengan zat warna. Beberapa contoh

mordant misalnya asam, basa, garam metal, dan yodium. Dengan adanya mordant,

zat warna akan lebih sukar tercuci. Pencuci warna digunakan untuk menghilangkan

zat warna dari sel bakteri.

Tes string kalium hidroksida (KOH) digunakan untuk membedakan isolat

bakteri. Lingkaran pertumbuhan dari koloni bakteri bercampur dalam suspensi 3%

KOH berair pada kaca slide. Tes ini dianggap positif jika suspensi seperti gel atau

menjadi kental dan keluar ketika loop diangkat, maka isolat adalah gram negatif.

Banyak metode atau tahapan standar yang dilakukan dalam mengidentifikasi

mikroba, salah satunya berdasarkan sifat kimiawinya. Sel terdiri dari berbagai bahan

kimia. Bila sel mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka sel ini memperlihatkasn

susunan kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh disini adalah bakteri.

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana

sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel

bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau

pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu

mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

 Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung

lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri

patogen, yang menyebabkan penyakit, spesies gram-negatif umumnya lebih

berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif Melihat dari berbagai devinisi

yang telah disebutkan diatas maka kami sangat tertarik untuk melakukan pengujian

guna untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi dari bakteri utamanya pada

bakteri yang ber gram positif dan gram negatif serta dapat mengetahui morfologi

bakteri aerob dan anaerob dengan cara pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis.

1.2. Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Apa tujuan dari pewaranaan gram?

2. Apa tujuan dari uji KOH?

3. Apa yang dimaksud dengan pewarnaan gram?

1.3. Tujuan dan Kegunaan

Tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Untuk mengetahui tahapan-tahapan uji KOH.

2. Untuk mengetahui tahapan-tahapan pewarnaan gram.

3. Untuk mengetahui bentuk-bentuk dari bakteri dibawah mikroskop.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

Pada pewarnaan Gram terdapat 2 jenis bakteri yaitu Gram positif dan Gram

negatif. Tujuan dari pewarnaan Gram ini yaitu untuk mempermudah melihat bakteri

secara mikroskopik, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, melihat struktur dalam

bakteri seperti dinding sel dan vakuola, dan menghasilkan sifat-sifat fisik serta kimia

khas dari bakteri dengan zat warna. Dalam pewarnaan, bakteri Gram positif berwarna

ungu sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah. Bakteri memiliki beberapa

bentuk yaitu bacillus (batang), coccus (bulat), dan spirilum (lengkung). Bakteri yang

berbentuk bacillus dibagi atas diplobacillus dan tripobacillus. Pada bentuk coccus

dibagi atas monococcus, diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah

anggur). Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan

tidak melengkung (Bulele et al., 2020).

Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik secara

konvensional maupun yang lebih spesifik secara molekuler. Identifikasi secara

konvensional dapat dilakukan dengan pengamatan ciri morfologi, pewarnaan Gram,

maupun dari aktivitas enzimatik. Teknik molekuler untuk identifikasi spesies suatu

bakteri salah satunya adalah dengan menggunakan analisis 16S rRNA. Sifat variatif

suatu basa dapat digunakan untuk melihat galur dalam spsesies yang sama. Urutan

basa 16S rRNA dapat memperlihatkan derajat persamaan yang rendah pada suatu

taksa (Wulandari dan Purwaningsih, 2019).

Uji Gram dilakukan dengan mencampurkan satu lup isolat bakteri pada kaca

objek yang telah ditetesi KOH 3% sebanyak 10 μL, kemudian diamati terbentuk

tidaknya lendir. Jika terbentuk lendir maka bakteri tersebut dikelompokkan ke dalam
Gram negatif namun jika tidak terbentuk lendir maka tergolong Gram positif. Bakteri

yang tahan terhadap asam memiliki ketahanan yang lebih besar terhadap kerusakan

membran akibat penurunan pH di-bandingkan bakteri yang tidak tahan terhadap

asam (Kurnia et al., 2016).

Bakteri merupakan mikroorganisme bersel tunggal dengan ukuran Panjang

0,5-10 u dan lebar 0,5-2,5 u. Karakteristik bakteri dilihat dari bentuknya, seperti bulat

(cocci), batang (spirilli), koma (vibrios). Tambahan struktur bakteri yang terpenting

diketahui cambuk (flagella), kapsul (capsule) dan endospora (endospore Flagella)

merupakan struktur tambahan di luar sel yang berbentuk cabuk halus yang tidak

terlihat di bawah miskroskop kecuali menggunakan teknik perwarnaan khusus.

Susunan flagella pada sel yang untuk diidentifikasi dan dikelompokkan menjadi dua

golongan, yaitu flagella peitrichous dan flagella polar (Arisandi et al., 2017).

Pengujian reaksi dengan KOH yakni biakan murni bakteri antagonis yang

berumur 24 jam disuspensikan diatas gelas objek yang sebelumnya telah ditetesi

dengan KOH 3 % kemudian diaduk menggunakan jarum ose. Suspensi bakteri yang

membentuk lendir menunjukkan bakteri temasuk Gram negatif. Apabila suspensi

tidak terangkat dengan jarum ose atau encer, menunjukkan bakteri Gram

Positif (Arriani et al., 2019).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk

mengelompokkan bakteri gram positif dan gram negatif. Perbedaan struktur,

komposisi didnding sel bakteri dan permeabilitas diantara kediua kelompok dinding

sel bakteri menyebabkan perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram

negatif. Pewarnaan gram bedasarkan kemampuan bakteri untuk menahan pewarna

primer (kristal ungu) atau kehilangan warna primer dan menerima warna tandingan

(sarfanim). Bakteri grm positif akan menunjukkan warna ungu sedangkan untuk

bakteri gram negative akan menunjukan warna merah (Jannah et al., 2017).

Identifikasi bakteri dengan pewarnaan Gram, pewarnaan spora, identifikasi

molekuler dengan gen 16S rRNA, dan menguji infektivitas pada ikan nila. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa isolat C3.10.16 memiliki indeks proteolitik tertinggi

yaitu 2,61 dan tidak patogen terhadap ikan nila dengan tingkat kelangsungan hidup

100% (Andriani dan Kasanah, 2018).

 III. METODE PRAKTIKUM

3.1. Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Praktikum Pembuatan Medium Biakan di laksanakan di Laboratorium Proteksi

Tanaman Unit Pendidikan, Fakultas Pertanian, Universitas Halu Oleo. Pada Hari Kamis,

27  Oktober 2022 Pukul 15.30 WITA sampai selesai.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu sampel tanaman sakit, sampel

tanah dari sekitar perakaran tanaman sakit, medium biakan (NBY, King’s B, YDCA,

TTC/TSB), aquadest steril, dan alcohol 70%, sarfanim, crystal violet, mordan lugol

iodine.

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah jarum ose, lampu bunsen,

mikroskop, dan pipet tetes dan kamera handphone.

3.3. Prosedur Praktikum

3.3.1. Pengujian KOH

Melakukan sterilisasi permukaan, kemudian mengambil kaca preparat lalu

sterilisasikan. Kemudian menyiapkan biakan bakteri dari isolat, dan mengambil

biakan bakteri sebanyak 1 ose, lalu melarutkan biakan pada larutan KOH 3% pada

kaca preparat. Mengamati lapisan peptidoligan bakteri, apabila mengental makan ber

gram negativ, apabila tidak mengental maka ber gram positif.

3.3.1. Pewarnaan Gram

Melakukan sterilisasi permukaan, kemudian menyiapkan kaca preparate yang

telah di sterilisasikan. Kemudian mengambil biakan bakteri sebanyak 1 ose lalu di

sebarkan pada kaca preparate kemudian tunggu hingga mengering. Setelah

mengering larutkan larutan crystal violet sebanyak 2 tetes pada biakan bakteri pada

kaca preparate kemudian tunggu hingga 1 menit lalu bilas dengan aquades.

Kemudian kering anginkan. Setelah mengering teteskan larutan iodin sebanyak 2

tetes lalu tunggu selama 1 menit, setelah itu membilas dengan aquades, kemudian

kering anginkan lalu bilas Kembali menggunakan alcohol selama 30 detik, setelah itu

bilas Kembali menggunakan aquades. Selanjutnya kering anginkan Kembali. Setelah

kering teteskan larutan safranin pada biakan sebanyak 1-2 tetes, tunggu salama 1

menit lalu bilas menggunakan aquades, setelah itu kering anginkan Kembali, lalu

tutup menggunakan penutup kaca preparate, lalu mengamati bentuk dan warna

bakteri di bawah mikroskop.

 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Hasil dari praktikum pewarnaan gram dan uji larutan KOH 3% pada koloni

bakteri patogen adalah sebagai berikut.

4.1.1. Pewarnaan Gram

Hasil pengamatan secara mikroskopis koloni bakteri Ralstonia solanacearum

yang telah diberi perlakuan pewarnaan gram.

a b
Gambar 4.1. (a). Pengamatan secara mikroskopis koloni bakteri isolat T. Tomat 10 -4, (b). Pengamatan
secara mikroskopis koloni bakteri isolat T. Tomat 10-7.

Berdasarkan gambar 4.1 dapat dilihat koloni bakteri Ralstonia solanacearum

yang telah diberi pewarnaan gram. Gambar (a). merupakan koloni bakteri yang

berhasil diisolasi pada pengenceran 10-4, sedangkan pada gambar (b). merupakan

koloni bakteri yang berhasil diisolasi pada pengenceran 10-7.

Tabel 4.1. Hasil Pewarnaan Gram Bakteri.

Reaksi Bentuk
No Kode Isolat Hasil Pewarnaan
Gram Bakteri

Tanah rhizosfer
1 Ungu (+) Positif Basil
T. Tomat 10-4

Tanah rhizosfer
2 Jingga kemerahan (-) Negatif Basil
T. Tomat 10-7

4.1.2. Pengujian KOH

Hasil pengamatan dari pengujian KOH terhadap koloni bakteri Ralstonia

solanacearum yang telah diberi perlakuan larutan KOH 3% adalah sebagai berikut.

a
Gambar 4.2. (a). Hasil pengujian KOH pada bakteri Ralstonia solanacearum dengan kode isolat T.
Tomat 10-4.

Berdasarkan gambar 4.2 dapat dilihat hasil pengujian KOH terhadap koloni

bakteri Ralstonia solanacearum dari isolat pengenceran 10-4 dan 10-7. Hasil pengujian

KOH yang lebih jelas dapat dilihat pada tabel 4.2.

Tabel 4.2. Hasil Uji Larutan KOH 3%.

Kode
No Nama Bakteri Reaksi Gram Keterangan
Isolat
T. Tomat Ralstonia
1 (-) Negatif Berlendir
10-4 solanacearum

T. Tomat Ralstonia
2 (+) Positif Tidak Berlendir
10-7 solanacearum

4.2. Pembahasan

Menentukan Gram suatu bakteri dapat dilakukan dengan uji KOH, dalam

praktikum pengecetan Gram dan pengujian KOH pada bakteri, langkah-langkah yang

dilakukan untuk uji Gram yaitu pertama-tama, mengambil satu ose biakan bakteri

dan mencampurkan dengan 2 tetes larutan KOH 3%, di atas gelas objek, kemudian

mengaduk secara merata dengan jarum ose, dan menarik jarum ose ke atas gelas

objek dan mengamati pembentukan lendir. Jika suspensi (campuran bakteri dengan

KOH) menjadi berlendir maka dinyatakan sebagai Gram negatif, jika tidak tampak

seperti lendir maka dinyatakan sebagai Gram positif.

Berdasarkan praktikum pengecatan Gram dan pengujian KOH pada bakteri,

maka dapat diketahui bahwa penentuan bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat

dilakukan dengan pengecatan Gram dan Pengujian KOH. Tes string kalium

hidroksida (KOH) digunakan untuk membedakan isolat bakteri. Lingkaran

pertumbuhan dari koloni bakteri bercampur dalam suspensi 3% KOH berair pada

kaca slide. Tes ini dianggap positif jika suspensi seperti gel atau menjadi kental dan

keluar ketika loop diangkat, maka isolat adalah gram negatif.

 Pada pengujian isolate dengan menggunakan isolat tanah pada tanaman tomat

yang bergejala hawar daun bakteri ada yang berlendir dan ada yang tidak berlendir.

Hasil yang berlendir menunjukkan bakteri tersebut merupakan Gram negatif karena

robeknya selaput pada bakteri yang dikenal dengan lisis dan menghasilkan bakteri.

Sedangkan yang tidak berlendir menunjukkan bakteri tersebut adalah bakteri positif

dikarenakan selaputnya tidak terjadi apa-apa.

Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada

komponen dinding selnya. Bakteri gram positif lapisan peptidoglikannya tebal

sehingga tidak mengalami lisis atau kebocoran sel, sedangkan bakteri Gram negatif

lapisan peptidoglikannya tipis sehingga mengalami lisis atau kebocoran sel akibatnya

berlendir. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi

peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan

peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Berdasarkan pewarnaan gram pada biakan bakteri yang dilakukan, dapat kita

lihat bahwa bakteri tersebut berwarna violet yang menandakan bahwa bakteri

tersebut bergram positif. Apabila diamati menggunakan mikroskop maka bentuk

bakteri yang ditemukan berbentuk baciil. Pada pengenceran tanah 10 -4 didapatkan

bakteri berwarna merah yang menandakan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri

bergram negative dengan bentuk bakteri coccus.

 V. SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan diatas maka dapat disimpukan bahwa :

1. Pewarnaan Gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri-bakteri ber Gram positif

atau ber Gram negatif.

2. Pengujian KOH bertujuan untuk mengetahui lapisan peptidoligan atau dinding sel

bakteri tipis atau tebal

3. Pewaranaan Gram merupakan suatu kegiatan yang bertujuan untuk mengidentifikasi

bakteri-bakteri yang belum diketahui sebelumnya.

5.2. Saran

Saran untuk praktikum selanjutnya yaitu agar praktikan dan asisten dapat lebih

bekerja sama dalam praktikum serta lebih banyak lagi biakan bakteri yang akan di amati

agar praktikan dapat lebih mengetahui Gram-Gram pada bakteri serta Praktikan dapat

lebih banyak mengetahui bentuk-bentuk dari bakteri.

 DAFTAR PUSTAKA

Arisandi A, Badrud T, Raini Y. 2017. Jumlah Koloni pada Media Kultur Bakteri
yang Berasal dari Thallus dan Perairan Sentra Budidaya Kappaphycus
Alvarezii Di Sumenep. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 9 (1) : 57-64.

Andriani S, Kasanah N. 2018. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Proteolitik Tanah

Hutan Bakau dari Palembang, Rembang, Cilacap dan Situbondo. Jurnal
Aquakultur. 5(3):13-16.

Arriani IF, Luqman QA dan Restu RK. 2019. Pemanfaatan Bakteri Antagonis
Lumpur Sidoarjo Untuk Menekan Sclerotium rofsii Sacc. Penyebab Penyakit
Rebah Semai pada Tanaman Kedelai. Jurnal Viabel Pertanian. 13 (1) : 11-20.

Bulele T, Rares FES dan Porotu’o J. 2019. Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan
Gram pada Penderita Infeksi Mata Luar di Rumah Sakit Mata Kota Manado.
Jurnal e-Biomedik (eBm). 7 (1) : 30-36.

Jannah R, Safika, Jalaludin M, Darmawi, Farida, Aliza D. 2017. Jumlah Koloni

bekteri selulolitik pada sekum ayam kampung. Jurnal Ilmiah Mahasiswa.
01(03):558-565.

Kurnia K, Sadi NH dan Jumianto S. 2016. Isolasi Bakteri Heterotrof Di Situ Cibuntu,
Jawa Barat dan Karakterisasi Resestensi Asam dan Logam. Jurnal Biologi. 9
(2) : 74-79.

Wulandari D, Purwaningsih D. 2020. Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri

Amilolitik Pada Umbi Colocasia esculenta L. Secara Morfologi, Biokimia dan
Molekuler. Jurnal Bioteknologi dan Biosains Indonesia. 6 (2) : 247-258.