1.

Judul: Identifikasi Mikroba

2. Tujuan:
Untuk mengetahui jenis mikroba dan bentuk sel dengan pewarnaan gram
3. Dasar Teori
3.1 Identifikasi mikroba
Bakteri banyak ditemukan dilingkungan luar dan kontaminasi dari dalam
ruangan. Hal ini disebabkan bakteri memiliki kemampuan untuk beradaptasi dan
menyesuaikan terhadap lingkungan, seperti bahan organic, udara, hewan, dan
manusia (Welkriana dkk., 2019). Proses identifikasi dilakukan dengan mengetahui
karakteristik bakteri yang tumbuh. Isolate yang digunakan dalam identifikasi ini
ialah biakan murni. Pengamatan morfologi koloni dilakukan secara makroskopis.
Secara makroskopis meliputi bentuk koloni bakteri, warna koloni, tepi koloni, dan
elevasi koloni (Putri dan Kusdiyantini, 2018).

3.2 Bakteri Gram Positif dan Negatif

Bakteri merupakan mikroorganisme yang tersering menyebabkan infeksi.

Bakteri dapat dibedakan mejadi bakteri gram negative dan gram positif. Bakteri
gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna A yang mengandung
kristal violet sewakt proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna ungu
jika dibawah mikroskop (Syahrurachman dkk., 2014). Bakteri gram positif
memiliki susunan struktur dinding sel bakteri yang lebih sederhana terdiri dari dua
lapis namun memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Contoh dari bakteri gram
positif adalah staphylococcus aureus. Kuman yang sering ditemukan pada mukosa
manusia dan kulit. Bakteri gram negative akan berwarna merah muda karena
warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat cat gram D sebagai warna
kontras. Bakteri gram negative memiliki dinding sel yang lebih kompleks terdiri
dari tiga lapis tetapi lapisan peptidoglikan tipis. Contoh bakteri gram negative
adalah Escherichia coli. Ini merupakan kuman oportunis yang banyak ditemukan
didalam usus besar manusia. Dari perbedaan dinding sel tersebut berpengaruh
terhadap kepekaan bakteri terhadap zat antibiotic (Syahrurachman dkk., 2014).
3.3 Pewarnaan diferensial

Teknik pewarnaan bakteri dibedakan menjadi empat macam yaitu pewarnaan

sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan diferensial dan pewarnaan structural
(Jiwintarum dkk., 2016). Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan bakteri
yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan
pewarnaan tahan asam. Dengan metode pewarnaan gram, bakteri dapat
dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negative
berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri
tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pewarnaan tahan asam ditunjukkan terhadap
bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar
menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya
karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan
akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun
sperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).
Pewarnaan diferensial juga dapat dikatakan sebagai pewarnaan yang akan
menampilkan perbedaan antar sel sel bakteri atau bagian bagian sel dari bakteri
(Jiwintarum dkk., 2016).

3.4 Kristal Violet

Kristal violet merupakan pewarna pertama, yang dapat masuk ke dalam

sitoplasma baik bakteri gram positif, maupun gram negative, dan memberikan
warna ungu sel (Muwani, 2015). Mikroorganisme yang mempertahankan
kompleks kristal violet-iodine tampak berwarna ungu kecoklatan di bawah
pemeriksaan mikroskopis. Mikroorganisme yang mempertahankan warna tersebut
dikategorikan sebagai gram positif, sedangkan yang berwarna merah
diklasifikasikan sebagai gram negative (Husain dan Wardhani, 2021).

Gram A (kristal violet) dan gram B (iodine) diteteskan pada ulasan bakteri
secara bergantian selama 1 menit, selanjutnya gram C (alcohol) dan gram D
(Safranin) juga diteteskan secara bergantian salama 0,5 menit. Pada bakteri gram
negative, kandungan lipidnya akan meluruh disebabkan karena perlakuan alcohol,
hal tersebut menyebabkan larutan kristal violet juga akan meluruh dan hilang.
Berbeda dengan bakteri gram positif, kandungan lipidnya yang tipis akan
menyebabkan bakteri tersebut mempertahankan warna kristal violet sehingga
terlihat berwarna ungu pada pengamatan dibawah mikroskop (Husain dan
Wardhani, 2021).

3.5 Safranin

Safranin merupakan pewarna yang digunakan dalam beberapa pewarnaan

preparate untuk memberikan warna merah (Saroh, 2011). Pada penambahan zat
warna safranin tidak menyebabkan perubahan warna pada bakteri gram positif,
karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding
sel. Pada bakteri gram negative, penambahan safranin menyebabkan sel bakteri
berwarna merah, karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium larut dan
dinding sel kemudian mengikat zar warna kedua. Fungsi zat warna safranin
hanyalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna kristal violet (Hidayat
dan Alhadi, 2012).

3.6 Larutan lugol

Lugol merupakan reagen yang sering digunakan untuk uji karbohidrat dan
fiksatif pengamatan mikroskopis. Kandungan lugol tersusun oleh kalium dan
iodium dengan perbandingan yang telah ditentukan. Lugol dalam pengamatan
mikroskopis menggunakan mikroskop berfungsi untuk fiksasi yang akan
memperlambat pergerakan dari protozoa dan digunakan sebagai pewarna sehingga
bagian dari penyusun sel protozoa dapat terlihat dengan jelas (Hastuti, 2009).
Lugol merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang digunaakn memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna
utama. Pemberian lugol ini dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna
oleh bakteri. Kompleks zat lugol akan terperangkap antara dinding sel dan
membrane sitoplasma organisme gram positif (Fardiaz, 1989).
3.7 Alkohol

Alkohol merupakan senyawa organic yang bergugus hidroksil (-OH) dan

umumnya berbentuk ethyl alcohol dan etanol (Atmaningsih, 2020). Alcohol ini
berfungsi untuk melunturkan warna dari bakteri. Jika bakteri masih
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol maka bakteri
tersebut merupakan bakteri gram positif, sedangkan pada bakteri gram negatif
tidak mempertahankan warna ungu gelapnya setelah dicuci dengan alcohol
(Ampou dkk., 2015).

3.8 Prinsip kerja mikroskop

Mikroskop adalah alat yang paling khas dalam laboratorium mikrobiologi

yang memberikan perbesaran yang membuat kita dapat melihat struktur
mikroorganisme yang tidak dapat dilihat oleh mata telanjang. Mikroskop memiliki
prinsip kerja yakni dengan memantulkan cahaya melalui cermin, lalu diteruskan
hingga lensa objektif. Di lensa objektif bayangan yang dihasilkan adalah maya,
tegak, terbalik, dan diperbesar. Kemudian bayangan akan diteruskan dan
menghasilkan bayangan yang tegak, nyata, dan diperbesar oleh mata pengamat
(Andriani, 2016).

4. metodologi praktikum

4.1 alat dan bahan

4.1.1 alat

Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini sebagai berikut

4.1.2 bahan

Adapun bahan yang digunakan pada praktikum ini sebagai berikut

4.2 skema kerja dan fungsi perlakuan

4.2.1 skema kerja

4.2.2 Fungsi perlakuan (belum lengkap jgn lupa dicek lagi dimodul)
Langkah awal sebelum memulai praktikum adalah menyiapkan alat dan bahan.
Adapun alat yang digunakan adalah. Adapun bahan yang digunakan adalah.
Diawali dengan menyemprotkan alcohol pada kaca preparate. Hal ini bertujuan
untuk mensterilisasi kaca preparate yang digunakan. Lalu dilakukan fiksasi
dengan memanaskan kaca preparate menggunakan Bunsen hal ini bertujuan untuk
mencegah adanya kontaminasi mikroba yang lain. Setelah itu dilakukan
pengambilan sampel mikroba menggunakan ose dan digoreskan pada kaca
preparat. Selanjutnya dilakukan fiksasi kedua pada kaca preparat dengan
mendekatkan kaca preparate pada Bunsen. Hal ini bertujuan untuk mencegah
adanya kontaminasi dari mikroba yang lain. Lalu sampel ditetesi larutan kristal
violet. Kristal violet ini bertujuan untuk memberikan warna ungu pada mikroba
yang akan diamati. Diamkan sampel yang telah ditetesi selama 2-3 menit. Setelah
itu dilakukan pencucian menggunakan air mengalir. Hal ini bertujuan untuk
menghilangkan larutran violet yang tidak terserap oleh mikroba. Selanjutnya
sampel ditetesi menggunakan lugol/mordan. Lugol ini digunakan sebagai warna
pelekat pada mikroba. Lugol juga digunakan untuk mengikat larutan kristal
dengan larutan safranin. Lalu sampel ditetesi dengan alkohol. Hal ini bertujuan
untuk mencuci larutan lugol. Setelah itu dilakukan pencucian menggunakan air
mengalir. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan sisa sisa alkohol. Kemudian
teteskan larutan safranin dan tunggu 1-2 menit. Larutan safranin digunakan
sebagai pemberi warna merah. Setelah itu dilakukan pengeringan pada suhu
kamar. Setalah sampel kering diteteskan dengan minyak imersi. Hal ini sebagai
pelekat kaca penutup dengan kaca preparate. Tutup sampel menggunakan kaca
penutup dan lakukan pengamatan menggunakan mikroskop.

5. hasil pengamatan

6. Pembahasan

6.1 Identifikasi mikroba dari yoghurt

 Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil pada sampel
yoghurt berwarna kecoklatan. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Ampou
dkk (2015) didapatkan hasil padaa sampel A mengindikasikan bakteri gram positif
dan dari gambar yang diambil dari mikroskop pada penelitian tersebut sesuai
dengan hasil dari praktikum yang telah dilakukan. Hal ini menunjukkan bahwa
terdapat bakteri gram positif karena bakteri mempertahankan warna dari kristal
violet dimana menurut Husain dan Wardhani (2021) Mikroorganisme yang
mempertahankan kompleks kristal violet-iodine tampak berwarna ungu
kecoklatan di bawah pemeriksaan mikroskopis. Mikroorganisme yang
mempertahankan warna tersebut dikategorikan sebagai gram positif, sedangkan
yang berwarna merah diklasifikasikan sebagai gram negatif. Umumnya fermentasi
pada yoghurt melibatkan bakteri Lactobacillus bulgaricus yang termasuk dalam
kelompok Bakteri Asam Laktat (BAL). Bakteri asam laktat yang termasuk dalam
bakteri gram positif yang dinding selnya hampir tersusun sepenuhnya oleh
peptidoglikon. Peptidoglikon yang terbentuk dari ikatan tiga dimensi dari gula
amino N-acetylglucoaminase dan N-acetyl murmaric acid yang akan
mempertahankan warna dari kristal violet karena memiliki kekuatan mekanik
dinding sel yang lebih kuat. Kekuatan mekanik dari dinding sel tersebut terbentuk
dari adanya ikatan silang peptide antara rantai peptidogliken (Hamidah dkk.,
2019).

6.2 identifikasi mikroba dari yakult

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan dengan sampel yakult pada
mikroskop menghasilakan warna ungu kecoklatan. Pada yakult umumnya
mengandung bakteri Lactobacillus casei dimana bakteri tersebut merupakan jenis
mikroba kelompok Bakteri Asam Laktat (BAL) (Khikmah, 2015). Jika ditinjau
dari warna yang dihasilakan pada sampel yakult maka termasuk pada bakteri gram
positif. Bakteri dengan gram positif akan menghasilkan warna ungu kecoklatan
ketika diamati menggunakan mikroskop. Hal ini disebabkan oleh tebalnya dinding
sel pada bakteri gram positif yang tersusun atas peptidogliken jika dibandingkan
dengan bakteri gram negatif yang memiliki dinding sel lebih tipis (Hamidah dkk.,
2019). Peptidogliken yang tebal akan mempertaahnkan warna dari kristal violet
meskiput telah diberi larutan pemucat. Perbedaan yang komposisi dinding sel
yang dimiliki oleh bakteri gram positif akan menyebabkan terdehidrasi saat
perlakuan alkohol sehingga menurunkan permeabilitas dan kompleks CV-I tidak
dapat terekstraksi, yang akhirnya mempertahankan warna ungu dari kristal violet
(Pelczar dkk., 1968).

6.3 identifikasi mikroba dari NA

Berdasarkan hasil praktikum menggunakan sampel media NA dengan lensa

100/ 1,25 menunjukkan warna merah kecoklatan. Hasil penelitian yang dilakukan
oleh Rahmatullah dkk (2021) pada cawan petri media Nutrient Agar (NA)
terdapat dua jenis bakteri yaitu basil dan kokus, yang disebabkan oleh peletakan
cawan petri. Jika dibandingkan dengan hasil praktikum hanya terdapat serpihan
serpihan yang diduga hal tersebut merupakan serpihan dari media yang
digunakan. Banyak faktor yang mempengaruhi proses pewarnaan gram pada
bakteri menurut Dwidjoseputro (2005) faktor faktor yang dapat mempengaruhi
pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur yang digunakan, substrat, intensifikasi
pewarnaan, penggunaan zat warna penutup dan alat yang digunakan. Pada
penelitian lain yang dilakukan oleh Aprihayanthi dkk (2022) pada media NA
diduga adalah Escherichia coli yang kemudian dilakukan pewarnaan gram dan
menghasilkan warna merah yang mengindikasikan bakteri tersbut masuk pada
kelompok bakteri gram negatif. Dimana pada bakteri gram negatif akan
menghasilkan warna merah hal tersebut dikarenakan bakteri gram negatif
cenderung tidak dapat mempertahankan zat warna ungu dibandingkan dengan
bakteri gram positif yang dapat mempertahankan warna ungu (kristal violet)
setelah dilakukan pencucian menggunakan alkohol (Putri dan Kusdiyantini,
2018). Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat pathogen, yang berarti
mereka berbahaya bagi organisme inang, sedangkan pada bakteri gram positif
umumnya bersifat tidak berbahaya. Sifat pathogen yang dimiliki oleh bakteri
gram negatif ini dipengaruhi oleh dinding sel bakteri gram negatif (Ampou dkk.,
2015).
6.4 identifikasi bakteri dari media EMBA

Berdasarkan hasil praktikum menggunakan sampel media EMBA dengan

lensa 100/ 1,25 menunjukkan warna ungu kemerahan dan terdapat serpihan
serpihan yang diduga adalah serpihan dari media EMBA dan lensa dari mikroskop
yang kotor. Pada hasil pratikum tidak ditemukan adanya mikroba hal tersebut
dapat dipengaruhi oleh beberapa hal menurut Dwidjoseputro (2005) faktor faktor
yang dapat mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur yang
digunakan, substrat, intensifikasi pewarnaan, penggunaan zat warna penutup dan
alat yang digunakan. EMBA adalah media selektif dan media diferensial. Dimana
media ini mengandung eosin dan metilen blue yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif. Maka umumnya media EMBA akan
menghasilkan bakteri gram negatif (Jamilatun dan Aminah, 2016). Pada bakteri
gram negatif menghasilkan warna merah karena zat safranin dapat menembus
membrane sel bakteri dan zat warna kristal violet yang ikut larut pada proses
pencucian menggunakan alkohol (Ginting dkk., 2018). Pada bakteri gram positif
zat penghilang warna akan mendegredasi dinding sel yang bertindak sebagai
penghalang permebilitas sehingga akan menahan warna dalam sel bakteri.
Sebaliknya, pelarut alkohol akan merusak membran luar dari bakteri gram positf
yang memiliki lapisan peptidogilkan yang tipis sehingga tidak dapat
mempertahankan warna dari kristal violet (pewarna) (Nester dkk., 2007).

7. penutup

7.1 kesimpulan

Pada praktikum ini dilakukan pewarnaan gram yang merupakan pewarnaan

diferensial. Pada praktikum digunakan 3 jenis reagen yaitu kristal violet, lugol,
dan safranin. Dengan pewarnaan gram yang telah dilakukan pada 4 sampel
didapatkan hasil terdapat 2 bakteri gram positif pada sampel yoghurt dan yakult
sedangkan sisanya adalah bakteri gram negatif pada sampel media NA dan
EMBA. Dimana bakteri gram positif menghasilkan warna ungu kecoklatan
sedangkan bakteri gram negatif menghasilkan warna kemerahan.
7.2 saran

Dalam melaksanakan praktikum, praktikan harus serius dalam setiap perlakuan

agar tidak terjadi kesalahan yang akhirnya berdampak pada hasil praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Ampou, E. E., I. Triyulianti., S. C. Nugroho. 2015. Bakteri asosiasi pada karang

Scleractinia kaitannya dengan fenomena la-nina di pulau bunaken. Jurnal
kelautan nasional. 10(2): 55-63

Andriani, R. 2016. Pengenalan Alat alat laboratorium mikrobiologi untuk

mengatasi keselamatan kerja dan keberhasilan praktikum. jurnal
mikrobiologi. 1(1) ISSN: 01A114084

Apriyanthi, D. P. R. V., A. S. Laksmita., N. P. Widayanti. 2022. Identifikasi bakteri

kontaminan pada gelang tri datu. Jurnal biologi makassar. 7(2): 24-33

Atmaningsih, D. T. 2020. Pengaruh pemberian alcohol terhadap sistem rangka.

Jurnal ilmiah Kesehatan sandi husada. 12(2): 806-811.

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi pangan. Bogor: IPB Press

Ginting, S. T. M., T. Z. Helmi., Darmawi., M. Dewi., Hennivanda., Erina., R.

Daud. 2018. Isolasi dan identifikasi bakteri gram negatif pada kambing
peternakan etawa (PE). Jurnal ilmiah mahasiswa veteriner. 2(3): 351-360

Hamidah, M. N., L. Rianingsih., Romadhon. 2019. Aktivitas antibakteri isolate

bakteri asam laktat dari pada dengan jenis beberapa terhadap E. coli dan S.
aureus. Jurnal ilmu dan teknologi perikanan. 1(2): 11-21

Hastuti, A. 2009. Efektivitas penggunaan ekstrak buah Breynia sp dan kencup

daun jati sebagai alternatif pengganti lugol pada kegiatan praktikum
pengamatan mikroskopis protozoa. Skripsi. Fakultas keguruan dan ilmu
Pendidikan. Universitas Muhammadiyah Surakarta

Hidayat, R., F. Alhadi. 2012. Identifikasi streptococcus equi dari kuda yang
diduga menderita strangles. Jurnal ilmu pertanian Indonesia. 17(3): 199-203
Husain, D. R., R. Wardhani. 2021. Baktri encosimbion cacing: kajian potensi
antibakteri secara in-vitro dan in-silico. Yogyakarta: Penerbit Deepublish

Jamilatun, M., Aminah. 2016. Isolasi dan identifikasi Escherichia coli pada air
wudhu di masjid yang berada di kota Tangerang. Jurnal medikes. 3(1): 81-
90

Jiwintarum, Y., I. Rohmi., I. D. P. M. Prayuda. Buah naga sebagai pewarna alami

untuk pewarnaan bakteri. Jurnal Kesehatan prima. 10(2):1726-1734

Khikmah, N. 2015. Uji antibakteri susu fermentasi komersial pada bakteri

pathogen. Jurnal penelitian saintek. 20(1): 45-52

Muwani, S. 2015. Dasar dasar Mikrobiologi Veteriner. Malang: UB Press

Pelczar, JR.M.J., E.C.S. Chan., N.R. Krieg. 1968. Microbiology. United States of
America: McGraw-Hill Inc.

Putri, A. L. O., E. Kusdiyantini. 2018. Isolasi dan identifikasi bakteri asam laktat
dari pangan fermentasi berbasis ikan (inasua) yang diperjualbelikan di
maluku- Indonesia. Jurnal biologi tropika. 1(2): 6-12

Rahmadatullah, W., E. Novianti., A. D. L. Sari. 2021. Identifikasi bakteri udara

menggunakan Teknik pewarnaan gram. Jurnal ilmu Kesehatan bhakti setya
medika. 6(2): 83-91

Saroh, S. 2011. Pemanfaatan Ekstrak Kulit Buah Naga (Hylocereus undatus) Dan
Ekstrak Ubi Jalar Ungu Varietas Ungu (Ipomoea batatas) Sebagai Pewarna
Alami Untuk Pengamatan Stomata. Skripsi thesis. universitas
muhammadiyah surakarta.

Syahrurachman, A. 2014. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Revisi ed. Jakarta:

Binarupa Aksara Publisher.
Lamgam