Mata Kuliah : Mikrobiologi Umum

IDENTIFIKASI MIKROBA
Pewarnaan Gram
Husnul Hatimah (G31115313)
Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Jurusan Teknologi Pertanian, Fakultas
Pertanian, Universitas Hasanuddin

I. Tujuan Praktikum
Tujuan yang dapat diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Untuk mengetahui fungsi identifikasi mikroba dalam bidang pangan.
2. Untuk mengetahui fungsi pewarnaan gram.
3. Untuk mengetahui fungsi setiap larutan pewarna.
II. Metode Percobaan
II.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum adalah ose bulat, kaca preparat, pinset, rak tabung,
stopwatch, dan mikroskop. Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah akuades, suspense
mikroba, larutan pewarna yang terdiri dari KKV, lugol, alcohol 96%, dan safranin.
II.2 Prosedur Percobaan
Pertama-tama alat dan bahan disiapkan. Ose bulat dan mulut tabung reaksi disterilkan
menggunakan bunsen, kemudian suspensi mikroba diambil menggunakan ose bulat dan dipindahkan
pada kaca preparat. Selanjutnya, kaca preparat difiksasi menggunakan nyala api bunsen. Suspensi
mikroba ditetesi larutan KKV selama satu menit dan dibilas dengan akuades yang mengalir secara
perlahan. Kemudian suspensi ditetesi lagi dengan larutan iod selama satu menit dan dibilas dengan
akuades yang mengalir. Suspensi ditetesi larutan alkohol selama 30 detik dan dibilas dengan
akuades yang mengalir. Kemudian suspensi ditetesi larutan safranin lalu dibilas menggunakan
akuades yang mengalir. Amati suspensi mikroba menggunakan mikroskop.
III.

Hasil dan Pembahasan

Prinsip kerja pewarnaan gram adalah memberi larutan warna pada suspensi bakteri untuk

mengklasifikasikan jenis bakteri yang termasuk gram positif dan gram negatif dengan menggunakan
larutan KKV, iodin, alkohol, dan safranin. Adapun hasil pengamatan praktikum ini dapat dilihat
pada tabel 13.
III.1 Hasil

Tabel 13. Hasil Identifikasi Mikroorganisme Metode Pewarnaan Gram

Gambar
No
Jenis Gram
Sebelum
Sesudah
1.
Gram Positif

2.

Gram Negatif

Bentuk
Coccus

Bacilli

Sumber: Data Primer Hasil Praktikum Laboratorium Mikrobiologi Umum, 2016.

III.2 Pembahasan
III.2.1 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan untuk mengetahui spesies bakteri yang
termasuk gram positif dan negatif beradasarkan sifat kimia dan dinding sel. Pewarnaan gram
dilakukan untuk mengetahui karakteristik bakteri yang dapat dengan mudah diidentifikasi
berdasarkan jenis gramnya. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna
metil ungu selama proses pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan tampak berwarna ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative tampak berwarna merah muda. Sedangkan
bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Manurung (2010), bahwa pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial
yang paling banyak digunakan dalam laboratorium karena suatu tahapan awal dalam
pengidentifikasian mikroba.
III.2.2 Fungsi Larutan
Larutan KKV (Kristal Kompleks Violet) merupakan reagen yang berwarna ungu sebagai
pewarna utama yang akan memberi warna pada mikroorganisme. Larutan KKV berfungsi untuk
memberi warna ungu pada sel bakteri positif karena dinding sel bakteri ini dapat mengikat larutan

tersebut. Hal ini sesuai dengan Entjaang (2003), yang menyatakan bahwa kristal violet merupakan
pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target.
Larutan iodin berfungsi untuk memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme
sehingga dapat mengintensifkan pengikatan warna oleh mikroba. Kompleks zat iodin terperangkap
antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. Iodin yang diteteskan selam
satu menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Purwoko (2010), bahwa iod merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang berfungsi
memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target.
Larutan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
mikroba. Pemberian alkohol pada pewarnaan dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan,
yaitu bakteri tetap berwarna ungu ataupun bakteri mengalami peluruhan warna menjadi merah
muda. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar
permeabilitas dinding sel sehingga memudahkan dalam proses pengamatan pada mikroskop. Hal ini
sesuai dengan pernyataan Purwoko (2010), bahwa alkohol merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme).
Larutan safranin berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna
utama setelah perlakuan dengan alkohol. Safranin memberikan warna pada mikroorganisme yang
tidak diinginkan serta menghadbiskan sisa-sisa pewarna. Hal ini sesuai dengan pernyataan
Wahyuningsih (2008), bahwa safranin merupakan pewarna pewarna sekunder untuk memberi warna
merah muda pada sel bakteri gram negatif.
III.2.3 Fungsi Pencucian Air
Fungsi pencucian air pada metode pewarnaan gram adalah zat-zat warna yang diberikan pada
sel bakteri terbilas sehingga tidak terdapat sisa zat pewarna yang dapat mempengaruhi hasil
identifikasi mikroba. Fungsi pencucian air juga berfungsi untuk mengatasi kelebihan zat warna yang
ada pada suspensi pada kaca preparat sebab salah satu hal yang mempengaruhi pewarnaan gram
adalah pelunturan warna. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sutedjo (1991), bahwa pewarnaan
bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi,
pewarnaan, dan penggunaan zat penutup.
III.2.4 Hasil
Berdasarkan praktikum yang dilakukan diperoleh hasil bahwa mikroba yang diidentifikasi
merupakan jenis bakteri gram positif dan gram negatif. Hal ini terlihat dari sel yang berwarna ungu
dan berbentuk sel basil (batang) dan coccus. Lactobacillus yang diamati dengan menggunakan

mikroskop tampak berwarna ungu. Oleh karena itu, dapat diketahui bahwa Lactobacillus merupakan
mikroba gram positif karena kristal violet sebagai warna primer dalam pewarnaan tidak luntur
warnanya meskipun diberi alkohol serta tidak berubah menjadi merah ketika diberi larutan safranin.
Kemampuan menyerap warna ini dapat dibedakan dengan ketebalan dinding selnya, yaitu dinding
sel Lactobacillus tebal sehingga tidak mudah menyerap warna. Hal ini sesuai dengan pernyataan
Pelczar (2007), bahwa bakteri garam positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat
pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya,
yaitu safranin. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi pada dinding
selnya.
IV. Simpulan
Simpulan praktikum identifikasi mikroba adalah sebagai berikut:
1. Identifikasi mikroba dalam bidang pangan dimaksudkan untuk mengetahui manfaat dan dampak
suatu mikroba pada makanan yang akan dikonsumsi, serta dapat dihindari kerusakan yang
diakibatkan mikroba tersebut.
2. Metode pewarnaan gram adalah proses mengidentifikasi bakteri gram dengan menggunakan
beberapa zat pewarna.
3. Larutan KKV berfungsi sebagai warna dasar untuk memberi warna ungu pada sel bakteri gram
positif, larutan iodin berfungsi untuk memfiksasi pewarna primer sehingga dapat
mengintensifkan pengikatan warna oleh bakteri, larutan alkohol berfungsi untuk melarutkan zat
warna pada sel bakteri, dan larutan safranin berfungsi sebagai pewarna sekunder untuk memberi
warna merah jambu pada sel bakteri gram negatif.

Daftar Pustaka
Entjaang I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademik Keperawatan. Jakarta: PT. Citra
Aditya Bakti.
Hadioetomo, Ratna Siri. 2000. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek,Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. PT Gramedia : Jakarta.
Iud, W. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Malang: UMM Pres.
Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. Makassar: Universitas Hasanuddin.
Pelczar, M.J. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.
Purwoko, Tjahjadi. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi UNS.
Sutedjo, dkk. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.
Wahyuningsih. 2008. Pengecatan Gram. Purwokerto: Universitas Jenderal Sudirman.