LAPORAN PRAKTIKUM

PEWARNAAN GRAM

DI SUSUN OLEH :
Venna Melinda

PROGRAM STUDI DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

FAKULTAS TEKNOLOGI KESEHATAN
UNIVERSITAS MEGA REZKY MAKASSAR
TAHUN AJARAN 2021/2022
 BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri
merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik,
bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air.
Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi. Hal itu untuk mempermudah proses identifikasi bakteri.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik
pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram
negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah.
Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat
diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai.
Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena
kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan
sampai kondisi menjadi baik (Rudi, 2010).
Pada praktikum proses pewarnaan gram olesan bakteri yang terfiksasi
dikenai larutan-larutan berikut dalam urutannya yaitu ungu kristal, larutan yodium,
alkohol (bahan pengecat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang
sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua
kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri gram positif, mempertahankan zat
pewarna ungu kristal. Di gunakan untuk pengecatan differensial, menggunakan
beberapa jenis zat, di gunakan untuk mengelompokkan bakteri, seperti pengecatan
gram atau pengecatan acid-fast, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal
ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna
merah safranin, tampak berwarna merah(Pelczar dan Chan, 1986).
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroorganisme yang
tidak dapat dilihat dengan mata telanjang untuk meneliti apa saja yang terkandung
di dalam mikroorganisme. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai
morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri
yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri
tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri
sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pewarnaan.
Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak
digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui
morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram
atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat
kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi
menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu
macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu
mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan
menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat
mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif
sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya
mekanisme pewarnaan gram.

B. TUJUAN PRAKTIKUM
Berdasarkan latar belakang, tujuan yang ingin dicapai pada praktikum iniadalah :
 Memahami pengertian pewarnaan bakteri
 Memahami macam – macam pewarnaan bakteri
 Memahami teknik pewarnaan gram pada bakteri untuk memisahkan
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak

mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang
menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme
ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya
sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan
zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang
digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus.
Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme
disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok
gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah
pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-
kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus
dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada
umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan
bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan
luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan
sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan
gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae
(Anonim, 2008).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang
membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif
akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna
metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan
berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram
negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur
dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Metode-metode dalam pewarnaan gram :

Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa,
Kristal violet. Larutan iodine kemudian ditambahkan, semua bakteri akan
diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alcohol. Sel gram positif
akan tetap mengikat senyawa Kristal violet-iodine, tetap berwarna biru, sel
warna negatifwarna hilang oleh alcohol. Sebgai langkah terakhir,
countersain (Mis.safranin pewarna merah) ditambahkan, sehinnga sel gram
negative yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras, sedangkan
sel gram positif terlihat dalam warna biru. Dasar perbedaan reaksi gram
adalah struktur dinding sel.
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan
segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, ada kemungkinan
penyimpangan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel
mengalami kerusakan pada dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini
menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan
pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding yang rusak
tidak lagi dapat mempertahankan kompleks warna Kristal violet-iodine
sehingga terlihat sebagai bakteri gram negative (Lay,1994).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus,
spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi
beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,
diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi
monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum
hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung
(Dwidjoseputro,1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil.
Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan
sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro,1998)
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay,1994)
Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain
pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial
yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel
mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik
pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri.
Menurut Hadioetomo (1991), dalam pewarnaan gram diperlukan empat
reagen yaitu :
 Zat warna utama (violet kristal)
 Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama.
 Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic
yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
 Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan
denga alcohol.

Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama
(ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi
dengan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan
itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua
kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang
tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut
gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna
asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram
negatif (Dwidjoseputro, 1998)
 Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna
metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna
biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan
berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini
terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar

yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga
pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah.
Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa
peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori
dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel
tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
 BAB III
METODE PRAKTIKUM

A. WAKTU PRAKTIKUM

 Sabtu 10 juli 2021

B. ALAT & BAHAN

ALAT
 Object glass
 Ose/nald
 Rak pewarna
 Gegep kayu
 Bunsen
 Mikroskop

BAHAN
 NaCL 0,9%
 Akuades
 Zat warna
 Cristal gentian violet, lugol, alkohol 70%

C. PRINSIP KERJA
Metode pewarnaan Gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang ahli
mikrobiologi Denmark yang bernama Hans Christian Gram saat mengamati
perbedaan bakteri Pneumococcus dan Klebsiella pneumoniae. Sehingga nama
Gram diabadikan menjadi nama teknik pewarnaan ini.
Teknik pewarnaan Gram secara langsung membedakan bakteri menjadi 2
kelompok, yaitu Gram positif dan Gram negatif.
Zat kimia yang digunakan dalam pewarna Gram adalah Crystal Violet dan Safranin
sebagai pewarna utama, Lugols Iodine sebagai mordant penguat ikatan warna dan
Alkohol sebagi agen penjernih warna (dekolorizer).
Sebagai pewarna Crystal Violet akan memberi warna ungu sedangkan safranin
akan memberi warna merah pada dinding sel bakteri.
Kedua kelompok bakteri tersebut dibedakan berdasarkan kandungan atau
konsentrasi peptidoglikan pada dinding sel.
Konsentrasi peptidoglikan yang tinggi (tebal) dimiliki oleh kelompok bakteri Gram
positif, sedangkan konsentrasi peptidoglikan yang rendah (tipis) dimiliki oleh
kelompok bakteri Gram negatif.

D. CARA KERJA
 Buat preparat ulas dengan mengulaskan 1-2 ose biakan bakteri diatas obek
glass dan difisasi dengan melewatkannya diatas api
 Teteskan cristal violet sebagai pewarna utama kepada dua preparat,
usahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama ± 1 menit
 Cuci dengan air mengalir
 Teteskan 2-3 tetes larutan mordant (lugol,s iodine) lalu tunggu ± 1 menit
 Cuci dengan air mengalir
 Beri larutan pemucat (alkohol 70%) setetes demi setetes hingga etanol yang
jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak (overdecoloorize)
 Cuci dengan air mengalir
 Teteskan air fuchsin dan tunggu selama ± 1menit
 Cuci dengan air mengalir
 Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan
(jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering diudara.
 Amati dengan mikroskop perbesaran 40x dan 100x (ditambah oil emersi)
 BAB IV
HASIL & PEMBAHASAN

A. TABEL PENGAMATAN
Teknik pewarnaan Pengamatan
Pewarnaan gram · Bentuk bakteri : Coccus
· Warna bakteri : Ungu
· Jenis bakteri : Staphylococcus
· Gram : Positif (+)

B. GAMBAR PENGAMATAN

C. PEMBAHASAN
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan
zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi
zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah.Perbedaan
zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding
selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal
violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding
sel bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas
zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).
 Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane.
Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram
klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan
obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal
(Sutedjo,1991).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan
sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol
pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain
klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang
rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur
kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya
identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin
tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering
mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai
indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991).
Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram positif dengan
warna ungu dan memiliki bentuk Monobacillus pada perbesaran mikroskop
10 hingga 100.
Berikut hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram
adalahsebagai berikut:
1. Fase yang paling kritis dari pewarnaan gram adalah tahap
dekolorisasiyang mengakibatkan iodine lepas dari sel. Pemberian
alkohol jangansampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi
yang berlebihsehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif.
Namun juga jangansampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol
yang tidak akan melarutkaniodine secara sempurna sehingga sel gram
negatif seperti gram positif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda
yangtidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh
padakemampuan sel menyerap warna utama khususnya pada gram
positif.Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis
sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh
umur.
 BAB V
PENUTUP

A. KESIMPULAN
Dari praktikum yang telah dilaksanakan praktikan dapat menarik kesimpulan
bakteri yang ditemukan berbentuk coccus dengan penataan diduga jenis
staphylococcus. Dan bakteri tersebut termasuk gram positif karena berwarna ungu.
Disebabkan menyusutnya pori-pori dinding sel sehingga pori-pori menutup dan
menghasilkan warna ungu.
 DAFTAR PUSTAKA
 Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. http : // mushoffaditya.
blogspot.   com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 5 Mei 2017.
 Anonim. 2008. Teknik Metode Dasar Mikrobiologi. Malang: UMM Press.
 Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan.
 Lay, Bibiana.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta.
 Pelczar. J. Michael dan Chan E.C.S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi.
Universitas Indonesia. Jakarta.
 Rudi, 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya. Wordpress, Makassar.
 Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta.
 Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press.