Laporan Praktikum ke: 4 Hari/Tanggal : Senin/27 Februari 2023

Mikrobiologi Nutrisi Tempat : Lab. Biokimia dan

Praktikum Mikrobiologi Nutrisi
Dosen : Prof. Dr. Ir. Komang G. Wiryawan
Nama Asisten : Inka Shal Sabilah (D24190023)
Tariza Ramadhania (D24190045)

PEWARNAAN GRAM

ABDURRAHMAN SHIDDIQ
D2401211140
P3/K1

DEPARTEMEN ILMU DAN NUTRISI TEKNOLOGI PAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2023
 I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Bakteri merupakan jenis mikroorganisme yang mempunyai beragam

karakteristik sehingga memerlukan suatu identifikasi untuk mengetahui jenis-jenisnya.
Idenifikasi bakteri dapat dilakukan melalui pengamatan morfologi, baik secara
makroskopis ataupun mikroskopis (Pratama 2018). Pengamatan morfologi bakteri
secara mikroskopis dilakukan dengan pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram merupakan
teknik pewarnaan yang digunakan untuk membedakan jenis bakteri menjadi dua
kelompok besar yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Pewarnaan Gram juga
dilakukan untuk mempermudah melihat bakteri secara mikroskopik, memperjelas
ukuran dan bentuk bakteri, melihat struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan
vakuola, dan menghasilkan sifat-sifat fisik serta kimia khas dari bakteri dengan zat
warna. (Hidayat dan Alhadi 2012). Dalam pewarnaan Gram, bakteri yang
menunjukkan warna ungu menandakan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Gram
positif. Sedangkan bakteri yang menunjukkan warna merah menandakan bahwa bakteri
tersebut adalah bakteri Gram negatif (Rahmatullah et al. 2021).

1.2. Tujuan

Praktikum ini bertujuan membedakan bentuk dan warna antara bakteri Gram
positif dengan Gram negatif
 II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pewarna Kristal Violet

Kristal violet adalah pewarna utama yang digunakan dalam pewarnaan Gram.
Kristal violet digunakan dalam tahap awal pewarnaan Gram untuk memberikan warna
ungu pada sel-sel bakteri, kemudian diikuti dengan larutan lugol dan asam alkohol
untuk menentukan sifat Gram dari bakteri tersebut. Secara umum, kristal violet adalah
senyawa kristal organik yang berwarna ungu dan larut dalam air. Kristal violet bekerja
dengan cara menembus dinding sel bakteri dan menempel pada membran sel (Waluyo
2022). Dalam pewarnaan Gram, kristal violet biasanya digunakan dalam konsentrasi
yang rendah, yaitu sekitar 0,1-0,25% dalam air. Kristal violet biasanya berperan
sebagai pewarna utama dalam pewarnaan Gram yang mewarnai sel bakteri Gram
positif. Selain itu, kristal violet juga digunakan dalam berbagai aplikasi lain seperti
dalam uji sensitivitas antibiotik (Rahayu dan Nurwitri 2022).

2.2 Pewarna Safranin

Safranin adalah pewarna sintetis yang sering digunakan untuk pewarnaan

mikroskopis. Safranin biasanya digunakan bersamaan dengan kristal violet dalam
pewarnaan Gram, yang digunakan untuk membedakan antara bakteri Gram positif dan
Gram negatif. Selain itu safranin juga dapat digunakan sebagai indikator dalam titrasi
asam-basa. Safranin akan berubah warna dari merah ke kuning ketika pH larutan
mencapai sekitar 7,2, yang biasanya menandakan titik ekivalen titrasi asam-basa.
Safranin dapat dilarutkan dalam berbagai pelarut, termasuk air, etanol, dan aseton.
Pemakaian larutan safranin yang terlalu kuat atau terlalu lama dapat menyebabkan
kerusakan sel dan memengaruhi hasil pengamatan mikroskopis, sehingga perlu
mengikuti prosedur pewarnaan yang benar dan mengontrol waktu pewarnaan dengan
hati-hati (Erdiandini et al. 2023).

2.3 Larutan I2 dalam KI

KI merupakan senyawa garam yang tersusun dari logam Kalium dan Iodium.
KI merupakan senyawa yang stabil dan tidak miudah rusak (Nisa et al. 2013). Senyawa
iodida sering terbentuk ketika KI ditambahkan ke dalam larutan yang melebihi zat
pengoksidasi. Karena jumlah I2 yang dihasilkan sama dengan jumlah oksidator yang
diberikan, kalium dari KI akan melepaskan I2, yang kemudian akan berikatan dengan
pati dan memberikan warna biru (Sawitri dan Maulina 2021). Fungsi larutan KI yang
mengandung I2 adalah untuk meningkatkan kelarutan dan mengurangi penguapan
iodine yang sukar larut dalam air dan agak larut dalam ion iodida (Refinel et al. 2011).

2.4 Minyak Imersi

 Minyak imersi adalah cairan yang digunakan dalam mikroskopi untuk
meningkatkan resolusi dan memperbesar gambar sampel yang diamati. Penggunaan
minyak imersi dalam mikroskop dapat mengurangi variabilitas gambar yang
dihasilkan, meningkatkan akurasi pengukuran, mengurangi kerusakan sampel dan
memperpanjang waktu pemeriksaan yang dapat digunakan. Jenis minyak imersi
dengan indeks bias yang lebih tinggi memberikan resolusi gambar yang lebih baik.
Namun lapisan minyak imersi yang terlalu tipis atau terlalu tebal dapat mengurangi
resolusi gambar (Teng et al. 2020).
 III. MATERI DAN METODE

3.1 Materi

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah kaca objek, mikroskop, lampu
spirtus, spidol permanen, tisu, ose atau spoit, dan syringe. Bahan yang digunakan pada
praktikum ini adalah kultur bakteri umur 24 jam, kristal violet (pewarna primer),
minyak imersi, aquadest, dan alkohol 70%.

3.2 Metode

Kaca objek dibersihkan terlebih dahulu menggunakan tisu dan alkohol 70 %,

kemudian difiksasi diatas pemanas api spirtus sampai kering, lalu pada kaca objek
dibuat lingkaran dengan menggunakan spidol pada permukaan bagian bawah kaca
objek, kultur bakteri yang akan dianalisa diambil menggunakan ose/spoit sebanyak
satu tetes, kemudian oleskan ditengah tanda lingkaran yang sudah dibuat di kaca objek,
kaca objek yang sudah ditetesi difiksasi diatas pembakar spirtus dengan gerakan
memutar sampai kering tetapi jangan sampai hangus. Setelah itu, larutan zat pewarna
kristal violet diteteskan diatas kultur yang sudah difiksasi dan dibiarkan selama 1
menit, bilas dengan aquadest samalkpai air bilasan tidak berwarna biru lagi (ketika
membilas dengan aquadet, aliran air jangan langsung mengenai preparat, karena
mungkin bakteri akan ikut terbilas), kemudian, larutan I2 dalam KI diteteskan ke atas
preparat sampai terendam dan biarkan selama 2 menit, bilas dengan larutan alkohol
sampai air bilasan tidak berwarna biru, dan bilas kembali dengan aquadest untuk
membersihkan sisa-sisa alkohol, selanjutnya teteskan kembali preparat dengan zat
pewarna safranin selama 30 detik, bilas kembali dengan larutan aquadest sampai
bilasan air tidak berwarna merah, lap sisa cairan dengan tisu jangan sampai preparat
ikut terhapus, setelah itu, tetesi preparat dengan minyak imersi sebanyak 1 tetes,
kemudian, lakukan pengamatan dengan mikroskop menggunakan lensa objektif
perbesaran 100x dan lensa okuler perbesaran 10 x, gambar dan amati bentuk dan warna
yang dihasilkan, setelah selesai mikroskop dibersihkan menggunakan tisu, serta alat-
alat yang digunakan dirapihkan dan dibersihkan kembali.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Pada praktikum kali ini kultur bakteri dilakukan pewarnaan Gram dengan
menggunakan pewarna kristal violet dan safranin. Berikut tabel perbandingan bakteri
Gram positif dan Gram negatif hasil literatur dan praktikum yang telah dilakukan.

Tabel 1. Perbandingan bakteri Gram positif dan Gram negatif

No. Hasil Literatur Hasil Praktikum

1.

Gambar 1 Bakteri Gram negatif Gambar 3 Bakteri Gram negatif

Sumber: Marbun et al. 2020 sampel A3
Sumber: Dokumentasi pribadi
2.

Gambar 2 Bakteri Gram positif Gambar 4 Bakteri Gram negatif

Sumber: Agustina et al. 2019 sampel K1
Sumber: Dokumentasi pribadi

4.2 Pembahasan

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang
paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Pewarnaan
Gram adalah teknik pewarnaan yang digunakan untuk membedakan jenis bakteri
menjadi dua kelompok besar yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Dalam
pewarnaan, bakteri Gram positif berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif
berwarna merah (Hamidah et al. 2019). Pewarnaan Gram selain untuk uji Gram positif
dan Gram negatif pada bakteri, juga dilakukan untuk mempermudah melihat bakteri
secara mikroskopik, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, melihat struktur dalam
bakteri seperti dinding sel dan vakuola, dan menghasilkan sifat-sifat fisik serta kimia
khas dari bakteri dengan zat warna (Hidayat dan Alhadi 2012). Teknik pewarnaan
Gram menggunakan zat warna kristal violet, I2 dalam KI, dan safranin. Bakteri
diwarnai dengan suatu zat warna kristal violet dan I2 dalam KI, dibilas dengan alkohol
kemudian diwarnai lagi dengan zat warna safranin (Putri et al. 2017).
Pembagian bakteri berdasarkan pewarnaannya dapat dibedakan menjadi dua
kelompok besar, yaitu bakteri Gram negatif dan bakteri Gram positif (Asril et al. 2022).
Menurut Silhavy et al. (2010), bakteri Gram positif merupakan jenis bakteri yang dapat
menahan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini
akan berwarna biru atau ungu di bawah pengamatan mikroskop. Umumnya bakteri
Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan tebal. Menurut
Koentjoro dan Prasetyo (2020), beberapa contoh bakteri Gram positif adalah Bacillus
subtilis, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Colstridium, dan lain-lain.
Sementara itu bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah
bila diamati dengan mikroskop (Bulele et al. 2019). Bakteri Gram negatif merupakan
bakteri yang dinding selnya terdiri dari lapisan lipopolisakarida atau yang biasa dikenal
sebagai endotoksin. Menurut Koentjoro dan Prasetyo (2020), beberapa contoh bakteri
Gram negatif adalah Escherichia coli, Rhizobium, Vibrio, Acetobacter, dan lain-lain.
Bakteri Gram positif memiliki beberapa perbedaan dengan bakteri Gram
negatif dalam beberapa hal. Menurut Koentjoro dan Prasetyo (2020), apabila dilihat
dari bentuk dinding selnya, bakteri Gram negatif memiliki bentuk dinding sel berlapis
ganda dan bergelombang, sedangkan bakteri Gram positif memiliki bentuk dinding sel
dengan lapisan tunggal, lurus dan rata. Dinding sel bakteri Gram positif lebih tebal
dibanding Gram negatif, yakni sebesar 80 nm Gram positif dan 7.5-15 nm Gram
negatif. Selain itu, proporsi peptidolikan bakteri Gram positif berada di kisaran yang
lebih dari 80%, sedangkan proporsi peptidoglikan bakteri Gram negatif hanya sebesar
2-12%. Bakteri Gram negatif memiliki beberapa bagian yang tidak dimiliki bakteri
Gram positif, di antaranya yaitu dinding sel dengan ruang periplasma, lipopolisakarida,
membran luar, magnetosom, dan porins (protein saluran membran). Hardiansyah et al.
2020 juga menyatakan bahwa pada umumnya bakter Gram positif lebih rentan terhadap
antibiotik dibanding bakteri Gram negatif yang lebih resistan terhadap antibiotik.
Bakteri Gram positif memiliki kandungan lipid yang rendah (1-4%), sedangkan bakteri
Gram negatif memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi (11-22%). Pertumbuhan
bakteri Gram positif juga umumnya dapat dihambat oleh zat-zat warna dasar seperti
zat kristal violet, sedangkan bakteri Gram negatif pertumbuhannya tidak begitu
dihambat.
Rumen merupakan salah satu bagian pada lambung ruminansia tempat
pencernaan makanan dengan proses fermentasi yang dilakukan oleh berbagai macam
mikroorganisme seperti bakteri, protozoa, dan fungi. Rumen mengandung 1010 - 1012
bakteri per gram isi rumen. Mayoritas bakteri rumen terdiri dari bakteri anaerob, serta
sedikit bakteri aerob. Bakteri rumen sangatlah beragam, berdasarkan karakteristik
permukaan selnya bakteri rumen dibagi menjadi bakteri Gram positif, Gram negatif,
dan mycoplasma. Mycoplasma sendiri mempunyai struktur lapisan sel tiga unit
membran (Nurhidayati et al. 2015). Sedangkan berdasakan bentuk morfologinya ada
yang berbentuk coccus yang menyerupai bola-bola kecil, cylindris yang menyerupai
batang kecil silindris, dan spirilla yang memiliki bentuk berbengkok-bengkok seperti
spiral (Yogyaswari et al. 2016). Beberapa contoh bakteri rumen Gram positif adalah
Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, dan
Methanobrevibacter. Sedangkan contoh bakteri rumen Gram negatif adalah
Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira, Bacteroides, Fibrobacter, Treponema,
dan lain-lain.
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan, didapati bakteri sampel A3
dan K1 ketika diberikan dengan pewarna kristal violet dan safranin keduanya
menghasilkan warna merah yang menandakan bahwa sampel tersebut merupakan
bakteri gram negatif. Hal ini sesuai dengan pernyataan Putri et al. (2017) yang
menjelaskan bahwa ketika diwarnai dengan kristal violet, bakteri Gram positif yang
memiliki peptidoglikan lebih bamyak akan menyerap zat warna kristal violet tersebut
sehingga menjadi ungu. Sementara itu, bakteri Gram negatif yang memiliki
peptidoglikan lebih sedikit dengan lipopolisakarida pada sel membrannya akan mudah
terbilas oleh alkohol sehingga menjadi tidak berwarna kembali, dan ketika diwarnai
dengan safranin akan menyerap warna merah dari safranin.
 V. SIMPULAN

5.1 Simpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, Dapat disimpulkan bahwa

pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang banyak digunakan
untuk mengidentifikasi bakteri. Pewarnaan Gram menggunakan zat pewarna kristal
violet dan safranin sebagai zat pewarnanya untuk memperjelas morfologi dari suatu
bakteri, dan membagi bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri Gram positif merupakan bakteri yang memiliki dinding sel dengan
lapisan peptidoglikan yang tebal dan akan berwarna biru atau ungu jika diwarnai
dengan pewarnaan Gram. Bakteri Gram negatif merupakan bakteri yang memiliki
dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tipis dan akan berwarna merah ketika
diwarnai dengan pewarnaan Gram.
 DAFTAR PUSTAKA

Agustina D, Mufida DC, Rifki H, Khrismashogi D. 2019. Uji sensitivitas antibiotik

terhadap Staphylococcus aureus yang terdeteksi dalam pasien dengan
pneumonia yang dirawat di rumah sakit. Journal of Agromedicine and Medical
Sciences. 5(1): 20 – 24.
Asril M, Ginting MS, Suyono, Arsi, Septariani DN, Risnawati, Joeniarti E, Adiwena
M, Pradana AP, Susanti Y et al. 2022. Pengantar Perlindungan Tanaman.
Medan (ID): Yayasan Kita Menulis.
Bulele T, Rares FES, Purotu’o J. 2019. Identifikasi bakteri dengan pewarnaan gram
pada penderita infeksi mata luar di rumah sakit mata kota manado. Jurnal e-
Biomedik. 7(1): 30 - 36. Doi: https://doi.org/10.35790/ebm.v7i1.22820.
Erdiandini I, Chusniasih D, Abidin Z, Nurfutriani A, Manalu AI, Istiadi KA, Suryanti
E, Junaedi AS, Marzuki I. 2023. Mikrobiologi Perairan. Yayasan Kita Menulis.
Hamidah MN, Rianingsih L, Romadhon. 2019. Aktivitas antibakteri isolat bakteri asam
laktat dari peda dengan jenis ikan berbeda terhadap E. Coli dan S. Aureus.
Jurnal Ilmu dan Teknologi Perikanan. 1(2): 11 - 21.
Hardiansyah MY, Musa Y, Jaya AM. 2020. Identifikasi plant growth promoting
Rhizobacteria pada rizosfer bambu duri dengan gram KOH 3%.
Agrotechnology Research Journal. 4(1): 41 - 46.
Hidayat R, Alhadi F. 2012. Identifikasi Streptococcus Equi dari kuda yang diduga
menderita strangles. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia. 17(3): 199 - 203.
Koentjoro MP, Prasetyo EN. 2020. Dinamika Struktur Dinding Sel Bakteri. Surabaya
(ID): Jakad Media Publishing.
Marbun RWS, Mardanif FN, Aini UF. 2020. Pemanfaatan sari ubi jalar ungu (Ipomoea
batatas poiret) sebagai zat pewarna pada pewarnaan gram terhadap bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Jurnal Analis Kesehatan Klinikal
Sains. 8(2): 82-89.
Nisa AZ, Sulistiarti H, Atikah. 2013. Penentuan kadar iodide secara spektofotometri
berdasarkan pembentukan kompleks iod-amilum menggunakan oksidator
persulfate. Kimia Student Journal. 1(1): 85-90.
Nurhidayati S, Faturrahman, Ghazali M. 2015. Deteksi bakteri patogen yang
berasosiasi dengan kappaphycus alvarezii (doty) bergejala penyakit ice-ice.
Jurnal Sains Teknologi dan Lingkungan. 1(2): 24-30. Doi:
https://doi.org/10.29303/jstl.v1i2.53.
Pratama EA. 2018. Isolasi dan uji potensi bakteri dari tempat pembuangan akhir
sampah sebagai biodekomposer dan biofertilizer [skripsi]. Malang (ID):
Universitas Muhammadiyah Malang.
Putri MH, Sukini, Yodong. 2017. Mikrobiologi. Jakarta Selatan (ID): Pusat Pendidikan
Sumber Daya Manusia Kesehatan.
Rahayu WP, Nurwitri CC. 2022. Mikrobiologi Pangan Edisi Revisi. Bogor (ID): PT
Penerbit IPB Press.
Rahmatullah W, Novianti E, Sari ADL. 2021. Identifikasi bakteri udara menggunakan
teknik pewarnaan gram. Jurnal Ilmu Kesehatan Bhakti Setya Medika p-ISSN.
6(2): 83-91.
Refinel, Kahar Z, Sukmawita. 2011. Transpor iondin memlalui membran klorofrom
dengan teknik membran cair fasa buah. Jurnal Riset Kimia. 5(1): 53-59. Doi:
https://doi.org/10.25077/jrk.v5i1.181.
Sawitri H, Maulina N. 2021. Derajat pH saliva pada mahasiswa ProGram Studi
Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Malikussaleh yang
mengkonsumsi kopi tahun 2020. AVERROUS: Jurnal Kedokteran dan
Kesehatan Malikussaleh. 7(1): 84-94. Doi:
https://doi.org/10.29103/averrous.v7i1.4729.
Silhavy TJ, Kahne D, Walker S. 2010. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor
perspectives in biology, 2(5). Doi: https://10.1101/cshperspect.a000414.
Teng L, Jiang X, Chen H, Zhang Y, Wu Y. 2020. Application of immersion oil in in
vivo multiphoton microscopy of human skin. Journal of Biophotonics. 13(6):
60-65.
Waluyo L. 2022. Mikrobiologi Pencegahan. Malang (ID): UMM Press.
 LAMPIRAN

Gambar 5 Laporan Sementara