Laporan Praktikum Mikrobiologi

Teknik Pewarnaan Bakteri

Oleh :

Nama : Fitria Miga Suryaningsih

NIM : 1304620070

Kelompok :6

Tanggal Praktikum : Senin, 24 Oktober 2022

Dosen : Annisa Wulan Agus Utami, S.Si., M.Si

Pendidikan Biologi A 2020

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Negeri Jakarta

2022
A. Tujuan Percobaan
1) Mengetahui teknik-teknik pewarnaan bakteri
2) Mempelajari cara pewarnaan gram dan mengamati sifat serta bentuk bakteri
terhadap pewarnaan gram
3) Dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif dengan
metode pewarnaan
4) Mengetahui macam-macam zat warna yang digunakan dalam teknik
pewarnaan bakteri
5) Dapat melakukan pewarnaan gram terhadap jenis bakteri

B. Pendahuluan
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil. Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat
berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri
merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk
bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih
sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar
mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan
keadaan struktur internal dan butiran. Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk
seperti bola/elips, batang, atau spiral (Pelczar, 2016).
Bakteri sulit dilihat menggunakan mikroskop cahaya karena tidak
mengabsorpsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai bakteri atau latar belakangnya. Zat warna
mengabsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan (Lay, dalam Jiwintarum, dkk, 2016). Metode
pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri
gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atausifat bakteri
terhadap cat tersebut.
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat
fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan
kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Berhasil tidaknya suatu pewarnaan
sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai
(umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan
adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan
negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna (Hadiutomo, 2011).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada
zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor
dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang
berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih
banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel,
membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat
warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Hadiutomo, 2010).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek.
Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah
cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati.
Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang
terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat.
Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh
kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo, 2011).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai
berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan
pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu :
pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk
melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin),
pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali, 2019).
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam
zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk
mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan
pewarnaan basa pada umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol ,
fuchsin , dan safranin (Lay, 2014).
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dan
sebagainya. Contoh pewarnaan khusus : Pewarnaan Endospora anggota dari
genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang
memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Tujuan dilakukannya pewarnaan
endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga
pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop
meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat
refraktil. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan sekelilingnya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel sperti spora flagela dan bahan inoklusi
yang mengandung zat pati dan granula fosfat (Lay, 2014).
Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling luas
digunakan dalam mengidentifikasikan bakteri. Pewarnaan dengan menggunakan
zat warna bertujuan untuk menggolongkan bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif. Bakteri gram positif dan gram negatif dibedakan berdasarkan struktur
dinding selnya. Struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana yaitu
berlapis tunggal dan struktur bakteri gram negatif lebih kompleks berlapis tiga
(Magdalena dan Kusnadi, 2015).
Pewarnaan gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2
yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pada pewarnaan gram ini,
reagen yang digunakan ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodine, alkohol dan
safranin. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal
violet sehingga ketika diamati mikroskop akan menunjukkan warna ungu,
sedangkan bakteri gram negatif tidak dapat mempertahankan warna ungu dari
kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga
akan memperlihatkan warna merah. (Pratita, 2012).
Pengecatan gram dilakukan pada kultur bakteri umur 24 jam yang
ditumbuhkan pada medium padat (Romadhon,2012). Sifat Gram suatu bakteri
 sangat berkaitan erat dengan sifat fisik dan kimia dinding sel suatu bakteri.
Karakteristik bakteri Gram positif adalah mempunyai kandungan peptidoglikan
yang tebal sedangan bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang
tebal pada dinding selnya. Perbedaan struktur diding sel ini menyebabkan bakteri
Gram positif mempunyai afinitas yang tinggi terhadap Kristal violet sedangkan
bakteri Gram negatif mempunyai afinitas yang rendah. Bakteri Gram positif
mampu membentuk komplek antara Kristal violet-lugol, sehingga ketika
ditambah dengan pelarut yang berisi alkohol akan menyebabkan sel mengalami
dehidrasi yang menyebabkan pori-pori menciut dan daya serap dinding sel
menurun sehingga komplek Kristal violet-lugol tidak dapat keluar dari sel
akibatnya sel tetap berwarna ungu (Rahmatullah, 2021).

C. Bahan dan Metode Praktikum

 Alat dan Bahan
1) Biakan Murni.
2) Larutan pewarna bakteri Gram.
1. Gram A : Larutan pewarna bakteri Hucker's Crystal Violet
2. Gram B : Larutan Mordan Lugol's Iodine.
3. Gram C Larutan peluntur (Aceton-Alkohol)
4. Gram D Larutan pewarna bakteri safranin.
3) Alkohol 70%.
4) Object glass
5) Lampu spiritus
6) Jarum ose.
7) Mikroskop.

 Cara Kerja
Menyiapkan pewarna bakteri :
Gram A : Larutan Hucker's Crystal Violet.
Larutan A : Crystal Violet 2 gram
Alkohol 95% 20 ml.
 Larutan B : Amonium Oksalat 0,8 gram.
Aquadest 80 ml.
Dicampurkan larutan A dan B tersebut.
Gram B : Larutan Mordan Lugol's Iodine.
Iodine 1 gram.
Kalium Iodine (KI) 2 gram.
Aquadest 300 ml.
Dicampurkan Iodine dan KI dalam mortar dan dihaluskan.
Ditambahkan aquadest sedikit demi sedikit sampai habis (300
ml).
Gram C : Larutan Pencuci (Alkohol-Aceton)
Alkohol 95% 70 ml
Aceton 30 ml
Gram D : Larutan Pewarna Bakteri Safranin.
Safranin 0,5 ml
Alkohol 95% 100 ml
Aquadest 100 ml
Dilarutkan safranin dalam alkohol, ditambah aquadest sampai
mencapai 100 ml.

Pewarnaan :
1) Dibersihkan object glass dengan alkohol 70%, diambil dengan jarum
ose suspensi bakteri kemudian ratakan.
2) Diteteskan larutan gram A sebanyak 2-3 tetes pada apusan bakteri,
kemudian dibiarkan selama 1 menit.
3) Dicuci dengan air yang mengalir, kemudian dikering-anginkan hingga
kering, atau keringkan dengan kertas isap secara hati-hati.
4) Diteteskan dengan gram B, dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci
dengan air mengalir, anginanginkan hingga kering.
5) Dicuci dengan gram C (larutan peluntur) selama 30 detik, lalu dicuci
dengan air mengalir, anginanginkan hingga kering.
 6) Diteteskan larutan gram D (larutan pewarna bakteri penutup), dibiarkan
selama 2 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
7) Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat.

D. Hasil Pengamatan

Gambar Bentuk Hasil Pewarnaan Nama Spesies

Bulat Ungu Bacillus cereus

Dokumentasi Kelompok 6
Perbesaran 100x

Bentuk belum
Merah Escherichia coli
terlihat jelas

Dokumentasi Kelompok 6
Perbesaran 40x
 Terdapat yang
bulat dan Ungu Escherichia coli
batang

Dokumentasi Kelompok 7
Perbesaran 40x

Terdapat yang Staphylococcus

Ungu
bulat dan aureus
batang
Dokumentasi Kelompok 7
Perbesaran 40x

Lactobacillus
Batang Ungu
acidophilus

Dokumentasi Kelompok 8
Perbesaran 100x

Batang Merah Escherichia coli

Dokumentasi Kelompok 8
Perbesaran 100x
E. Pembahasan
Pada praktikum kali ini kelompok dari kloter 2 PBA diberikan bakteri
yang berbeda-beda, terutama untuk bakteri gram positif, sedangkan untuk bakteri
gram negatif semua kelompok diberikan Escherichia coli untuk diujikan. Setelah
dilakukan pewarnaan bakteri dan pengamatan mikroskop, bakteri menghasilkan
warna dan juga bentuk yang berbeda-beda. Kelompok 6 melakukan pewarnaan
dan pengamatan terhadap bakteri Bacillus cereus dengan perbesaran 100x dan
terlihat hasilnya yaitu bakteri berbentuk coccus (bulat) dan berwarna ungu. Hasil
tersebut menunjukkan bahwa bakteri Bacillus cereus merupakan bakteri gram
positif karena setelah pewarnaan menghasilkan warna ungu. Sedangkan untuk
bakteri Escherichia coli setelah pewarnaan dan pengamatan mikroskop pada
perbesaran 40x dapat dilihat bahwa bentuk dari baketri ini belum dapaat terlihat
dengan jelas, hal tersebut mungkin terjadi karena faktor mikroskop yang kurang
baik atau biakan bakteri yang kurang baik. Adapun untuk warna, bakteri
Escherichia coli berwarna merah yang menandakan bahwa bakteri tersebut
merupakan bakteri gram negatif.
Kelompok 7 melakukan pengujian terhadap bakteri Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli. Untuk Staphylococcus aureus dengan perbesaran
40x terlihat bentuk bakteri yaitu coccus (bulat) dan basil (batang) dan berwarna
ungu, dimana hasil tersebut menunjukkan bahwa bakteri Staphylococcus aureus
adalah bakteri gram positif. Untuk bakteri Escherichia coli dengan perbesaran
40x terlihat bentuk bakteri yang sama seperti bakteri Staphylococcus aureus yaitu
coccus (bulat) dan basil (batang). Namun untuk hasil pewarnaan bakteri
Escherichia coli kelompok 7 ini terdapat ketidaksesuaian dengan penelitian-
penelitian sebelumnya, seperti berdasarkan penelitian Khairunnida, et al. (2020)
menyatakan Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang
pendek yang memiliki panjang sekitar 2 µm.. Terdapat beberapa kemungkinan
yang menyebabkan hal ini terjadi, yaitu biakan bakteri yang seharusnya
Escherichia coli terkontaminasi bakteri lain sehingga hasil pewarnaan
menunjukkan hal tersebut, atau karena pada saat proses mencuci dengan air
mengalir setelah ditetesi crystal violet tidak dilakukan dengan baik.
 Kelompok 8 melakukan pengujian terhadap bakteri Lactobacillus
acidophilus dan Escherichia coli. Untuk bakteri Lactobacillus acidophilus
berdasarkan pengamatan 100x yaitu berbentuk basil (batang) dan berwarna ungu,
yang berarti bakteri Lactobacillus acidophilus adalah bakteri gram postif.
Sedangkan bakteri Escherichia coli pada perbesaran 100x terlihat berbentuk basil
(batang) dan berwarna merah, yang berarti bakteri ini merupakan bakteri gram
negatif. Untuk kelompok 9 dan 10 melakukan pengamatan pada jenis bakteri
yang sama dengan kelompok sebelumnya dan belum mendapatkan hasil yag baik,
sehingga hasilnya tidak dimasukkan dan dibahas pada laporan ini.
Fungsi pewarnaan adalah mempermudah melihat bentuk jasad, baik
bakteri, ragi, maupun fungi, memperjelas ukuran dan bentuk jasad, melihat
struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad, melihat reaksi jasad
terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat
diketahui.hal ini sesui dengan Khariri (2019), yang menyatakan bahwa
pewarnaan Gram dapat membedakan antara bakteri Gram positif dan Gram
negatif. Metode ini masih banyak digunakan di banyak fasilitas laboratorium
mikrobiologi karena waktu pemeriksaan yang singkat dengan prosedur yang
sederhana.
Pada bentuk bakteri basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil,
dan tripobasil. Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan
hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan
sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2018).
Bakteri Gram positif akan berwarna ungu hal ini disebabkan kompleks
zat warna kristal violet yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan
pemucat, sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah disebabkan kompleks
tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucatdan kemudian mengambil zat
warna kedua yang berwarna merah. Perbedaan ini disebabkan perbedaan struktur
 kedua kelompok bakteri tersebut. Hal ini sesui dengan Fitri (2011), yang
menyatakan bahwa bila hasil pewarnaan diperoleh bakteri berwarna merah maka
bakteri tersebut adalah bakteri gram negatif, sedangkan bila diperoleh bakteri
berwarna ungu maka bakteri tersebut adalah gram positif.

F. Kesimpulan
 Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur
luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,
menghasilkan sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat
warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
 Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling luas
digunakan dalam mengidentifikasikan bakteri.
 Pewarnaan gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2
yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
 Bakteri Gram positif akan berwarna ungu hal ini disebabkan kompleks zat
warna kristal violet yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan
pemucat/dekolorisasi
 Bakteri Gram negatif berwarna merah disebabkan kompleks zat warna
kristal larut sewaktu pemberian larutan pemucat/dekolorisasi dan
kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna merah.
 Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, dan Lactobacillus acidophilus
merupakan bakteri gram positif karena menghasilkan warna ungu setelah
dilakukan pewarnaan dan pengamatan mikroskop
 Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif karena menghasilkan
warna merah setelah dilakukan pewarnaan dan pengamatan mikroskop

G. Daftar Pustaka
Dwidjoseputro. (2018). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Gozali, Amir. (2019). Pewarnaan Gram. Jakarta: PT Raja Grafindo.
Hadiutomo R. (2011). Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi.
Jakarta: Gramedia.
Jiwintarum, Y., dkk. (2018). Dragon fruit (Hylocereus polyrhizus) as Natural
Dyes Staining for Bacteria. Jurnal Kesehatan Prima. 10(2). pp. 1726-1734
Khairunnida, et al. (2020). Isolasi dan Identifikasi Bakteri Escherichia coli
Penyebab Waterborne Disease pada Air Minum Kemasan dan Isi Ulang.
Jurnal Ilmiah Kesehatan Sandi Husada, Vol. 9, No. 2. Bandar Lampung:
Universitas Malahayati.
Khariri dan Nelly P. (2019). Proporsi Metode Pendekatan Sindrom dan
Pewarnaan Gram dalam Diagnosis Infeksi Neisseria gonorrhoeae pada
Wanita Penjaja Seks (WPS). Journal On Medical Science. Vol. 6(1).
Lay, Bibiana, W. (2014). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja
Grafindo Persada.
Magdalena, N.V dan Joni Kusnadi. (2015). Antibakteri dari Ekstrak Kasar Daun
Gambir (Uncaria Gambir var Cubadak) Metode
Microwaveassistedextraction terhadap Bakteri Patogen. Jurnal Pangan dan
Agroindustri 3(1) :124-135
Pelczar, M.J. (2016). Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. Jakarta: UI press
Pratita, Maria Yuli E., Surya Rosa P. (2012). Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Termofilik dari Sumber Mata Air Panas di Songgoriti Setelah Dua
HariInkubasi. Jurnal Teknik Pomits. Vol. 1, No. 1
Rahmatullah, W., et al. (2021). Identifikasi Bakteri Udara Menggunakan Teknik
Pewarnaan Gram. Jurnal Ilmu Kesehatan Bhakti Setya Medika. Vol (6), No
(2), Hal 83-91.
Romadhon, Subagiyo, Sebastian M. (2012). Isolasi dan Karaterisasi Bakteri
Asam Laktat dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin sebagai Agen
Antibakteria Produk – Produk Hasil Perikanan. Jurnal Saintek Perikanan.
Vol. 8, No. 1
Sutedjo, M. (2011). Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.
Lampiran