Identifikasi Mikroorganisme

apt. Alfian Syarifuddin, M. Farm

 Tujuan Pembelajaran
Menganalisis cara
identifikasi Mikoorganisme
(Bakteri dan Fungi)

Ketepatan menganalisis cara

identifikasi bakteri
PENGAMATAN MIKROSKOP
Mikroskop merupakan suatu alat yang digunakan untuk melihat benda berukuran mikro agar
tampak lebih besar dan jelas. Jenis Mikroskop dibagi menjadi 2 macam, yaitu:

Mikroskop Optik Mikroskop Elektron

Mikroskop optik bekerja dengan membiaskan Mikroskop elektron dibagi menjadi 2 macam,
cahaya lampu oleh lensa condenser kemudian yaitu Mikroskop Scanner Electron dan
sinar mengenai spesimen dan diteruskan oleh Mikroskop Transmission Elektron.
lensa objektif. Sinar ditangkap oleh lensa
okuler setelah diteruskan oleh lensa objektif,
kemudian diteruskan kembali oleh mata atau
kamera. Mikroskop sederhana memiliki
perbesaran dari 400x hingga 1400x
Mikroskop elektron dibagi menjadi 2 macam, yaitu:

a. Mikroskop Scanner Electron

b. Mikroskop Transmission Elektron
Pembuatan Preparat

Preparat terdapat dua macam berdasarkan ukurannya,

yaitu:

1.preparat mikroskopis
2.preparat makroskopis
Preparat Mikroskopis

Preparat mikroskopis tidak hanya digunakan sebagai alat diagnostik, namun juga dapat
digunakan untuk bahan ajar untuk memahami berbagai bentuk, ukuran, sifat sel, tipe
sel, komponen, dan susunan jaringan yang menyusun organ tubuh suatu individu

a. Preparat Smear atau oles

b. Preparat Polen
c. Preparat Squash
d. Preparat Whole mount
e. Preparat Irisan
Preparat irisan memiliki 2 macam jenis, yaitu:

1. teknik Embedding dan

2. teknik Non-Embedding
1) Teknik Embedding
Embedding merupakan teknik penanaman yaitu suatu proses memasukkan atau
menanamkan jaringan ke dalam balok-balok paraffin atau cetakan. Tujuan dari teknik ini
adalah untuk memudahkan proses penyayatan dengan menggunakan bantuan mikrotom.
Tahap ini digunakan untuk membuat balok paraffin berisi jaringan yang akan dibuat
menjadi preparat permanen.

2) Teknik Non-Embedding
Preparat Non-Embedding merupakan preparat yang disayat tanpa menggunakan paraffin
seperti pada ranting atau batang. Ranting atau batang tidak dapat menggunakan teknik
Embedding karena bentuknya yang keras sehingga akan menyebabkan bahan terlalu keras
dan susah untuk diiris.
Metode yang digunakan untuk melunakkan bahan yang keras

a) Bahan yang keras namun dapat diiris

Bahan yang keras direndam menggunakan alkohol 70% dimana alkohol berfungsi sebagai
pelumas dan pelunak bahan. Cara ini dapat memudahkan pengirisan bahan dan bahan
tidak menjadi pecah.

b) Bahan yang keras namun tidak dapat diiris

Bahan keras direbus dengan air mendidih hingga lunak. Tujuan dari perebusan adalah
untuk mengeluarkan gelembung udara yang terdapat di dalam jaringan. Gelembung uda
yang berada dalam jaringan dapat menghambat pergantian bahan kimia didalam jaringan.
Bahan yang telah direbus kemudian disimpan dalam campuran gliserin dan alkohol 95%
dengan perbandingan 1:1 hingga bahan tidak pecah ketika diiris. Bahan yang tidak pecah
ketika diiris selanjutnya dicuci dengan alkohol 70% dan dilakukan pengirisan.
c) Bahan yang keras namun tidak dapat diiris serta mengandung silika
Bahan keras direbus selama 1 jam kemudian disimpan ke dalam larutan Hydrofluoric
acid 25% — 30% selama 4 — 6 minggu. Tujuannya adalah untuk menghilangkan silika
yang menyebabkan pengerasan. Bahan dicuci menggunakan air mengalir selama 2 jam
untuk menghilangkan larutan Hydrofluoric acid pada bahan keras. Bahan selanjutnya
disimpan pada campuran gliserin dan alkohol 95% dengan perbandingan 1:1 hingga
lunak kemudian dicuci menggunakan alkohol 70% dan dilakukan pengirisan.
Cara membuat preparat

a. Kaca objek dibersihkan menggunakan etanol atau alkohol.

b. Kode organisme dituliskan pada bagian sudut kanan menggunakan spidol.
c. Spesimen diletakkan diatas kaca objek kemudian ditetesi air suling.
d. Tutup spesimen dengan cover glass menggunakan bantuan jarum panjang
kemudian tetesi dengan pewarna pada ujung kaca penutup.
e. Spesimen dapat diamati pada preparat di mikroskop.
Klasifikasi Pengecatan
Pewarnaan pada bakteri dapat dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya
dengan memasukkan zat warna ke dalam tubuh bakteri sebagai deteksi awal agar dapat
dideteksi secara mikroskopis
Pewarnaan bakteri berdasarkan teknik pengecatannya
dibagi menjadi 4 macam, yaitu:

1. pengecatan sederhana,
2. pengecatan gram,
3. pengecatan diferensial, dan
4. pengecatan struktural
1. Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana merupakan pewarnaan bakteri ataupun jasad-jasad renik
menggunakan larutan tunggal pada lapisan tipis atau olesan yang telah difiksasi. Pewarnaan
sederhana menggunakan larutan tunggal berfungsi untuk meningkatkan kontras bakteri
dengan latar belakangnya. Larutan yang digunakan pada pewarnaan sederhana biasanya
bersifat basa seperti gentian violet, methylen blue, safranin, karbol fuchsin, atau malachit
green. Pewarnaan sederhana dapat digunakan untuk membedakan bakteri dengan bermacam-
macam tipe morfologi seperti coccus (bulat), bacillus (batang), vibrio (koma), dan lainnya dari
bahan yang terdapat pada preparat yang akan diwarnai
Pewarnaan sederhana terdapat 2 macam jenis yaitu pewarnaan
negatif dan pewarnaan positif
a. Pewarnaan Positif
Pewarnaan positif dilakukan dengan membuat ulasan bakteri diatas object glass kemudian difiksasi
untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Bakteri yang digunakan tidak bole terlalu padat dan terlalu cair karena mempersulit pada saat
pengamatan menggunakan mikroskop. Metode yang dilakukan untuk melakukan pewarnaan positif
adalah :
1) Object glass terlebih dahulu dibersihkan menggunakan kapas kemudian tulis kode bakteri disudut
atas object glass.
2) Apabila bakteri yang digunakan berbentuk cair maka dipindahkan sebanyak 1 tetes menggunakan
pipet tetes atau jarum inokulum. Sebelumya, biakan dikocok terlebih dahulu.
3) Apabila bakteri yang digunakan berbentuk padat maka dipindahkan menggunakan jarum inokulum
satu ulasan kemudian ditambahkan aquades dan disebarkan secara merata.
4) Ulasan dikeringkan bersamaan dengan difiksasi dengan api bunsen sebanyak 2 – 3 kali.
5) Biakan yang telah benar-benar kering dan tersebar kemudian ditetesi menggunakan pewarna seperti
methylen blue, safranin, crystal violet, atau pewarna lainnya dan tunggu selama 30 detik.
6) Cuci menggunakan aquadest kemudian dikeringkan dengan tissu, biakan dapat diperiksa
menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 x 10.
b. Pewarnaan Negatif
Beberapa bakteri dapat mudah diamati menggunakan pewarnaan negatif dibandingkan
dengan menggunakan zat warna basa. Hal tersebut diakibatkan oleh zat warna basa yang
tidak akan mewarnai sel namun mewarnai lingkungan sekitarnya sehingga sel terlihat
transparan dengan latar belakang hitam. Metode yang dilakukan untuk pewarnaan
negatif adalah :
1) Object glass ditetesi nigrosin atau tinta cina pada ujung kanan salah satu object glass.
2) Ulaskan atau teteskan biakan dalam nigrosin kemudian dicampur kemudian sisi object
glass yang lain ditempelkan dan gesekkan ke samping kiri.
3) Preparat dibiarkan mengering di udara dan tidak difiksasi.
2. Pengecatan Diferensial

Teknik pewarnaan diferensial menggunakan teknik pengecatan yang menampilkan

perbedaan diantara sel-sel atau bagian-bagian bakteri

3. Pengecatan Diferensial
Pengecatan Gram bertujuan untuk mempermudah mengidentifikasi bakteri secara mikroskopik
sehingga dapat melihat bentuk bakteri, struktur bakteri seperti dinding sel dan vakuola, memperjelas
ukuran bakteri, dan menghasilkan sifat-sifat fisik serta kimia khas dari bakteri
Pengecatan gram
• Metode pengecatan ini ditemukan oleh Christian Gram pada
tahun 1884.
• Bakteri gram + = bakteri yang dalam pengecatan tahan terhadap
alcohol sehingga tetap mengikat cat pertama dan tidak
mengikat cat kontras sehingga warna akhir ungu
• Bakteri gram - = bakteri yang dalam pengecatan gram tidak
tahan alcohol sehingga warna pertama dilunturkan dan bakteri
akan mengikat warna kontras merah.

www.themegallery.com
www.themegallery.com
 Teori Dasar Perbedaan Kedua Golongan Bakteri

1. Teori Salton
• Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20%) di dalam dinding sel
bakteri gram negative yang larut dalam pembilasan dengan alkohol.
• Pori-pori dalam dinding sel membesar sehingga, sehingga zat warna yang
sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna

www.themegallery.com
• Bakteri gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding sel
karena pencucian dengan alkohol.
• Protein menjadi keras dan kaku, pori-pori mengecil sehingga kompleks
ungu kristal yodium dipertahankan dan bakteri tetap berwarna ungu

www.themegallery.com
 Komposisi cat Gram

Cat Komposisi Jumlah

Cat Gram A Cristal Gentian Violet 2 gram
(warna ungu) (CV)
Alkohol 96% 20 cc
Ammonium Oxalat 1% 80 cc
in aqua
Cat Gram B Iodium 1 gram
(warna coklat) Kalium Iodida 2 gram
Aquadest 300 cc
Cat Gram C Aceton 30 cc
(tak berwarna) alkohol 70 cc
Cat Gram D Safranine 1 gram
(safranin) Alkohol 96% 10 cc
aquadest 90 cc
www.themegallery.com
Cara Pengecatan Gram
Preparat diambil satu ose dari koloni yang tumbuh
pada Media Agar, diratakan pada obyek gelas sehingga
membentuk diameter 1-2 cm. Fiksasi dilakukan dengan
cara melewatkan beberapa kali di atas api.
Preparat digenangi cat Gram A 1-3 menit cat dibuang
tanpa dicuci, Genangi dengan cat Gram B 1/2 –1 menit,
Cat di buang dan preparat dicuci dengan air.

Tetesi dengan cat Gram C sampai warna tepat

dilunturkan, setelah itu preparat dicuci dengan air.

Preparat digenangi cat Gram D 1-2 menit, kemudian

dicuci dan dikeringkan pada suhu kamar pada posisi
miring.

Periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat.

Pada pemeriksaan mikroskop akan terlihat jelas kontras
warna antara bakteri dengan sekitarnya.
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Hasil pengecatan Gram S. aureus dan E. coli
• Hal-hal yang perlu diperhatikan
1. Fase yang paling kritis adalah tahap decolorization yang
menyebabkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian etanol berlebih
mengakibatkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak
seperti gram negative, namun jangan terlalu sedikit.

www.themegallery.com
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur
muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur berpengaruh
pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada
gram positif. Mungkin menampakkan gram variable yaitu satu jenis
sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh
umur.

www.themegallery.com
Contoh Bakteri
Contoh bakteri Gram Positif :
• Bentuk kokus : Streptococcus, Staphylococcus, Pneumococcus,
Peptococcus, Peptostreptococcus
• Bentuk batang : Corynebacterium diphtheriae, Mycobacteria,
Bacillus, Clostridia.
Contoh bakteri Gram negative
• Bentuk kokus : Neisseria, Veillonella
• Bentuk batang : E.coli, shigella, Salmonella, Klebsiela, hemphillus,
Pasteiurella, Bacteroides, Fusobacterium, Brusella.

www.themegallery.com
IDENTIFIKASI SECARA BIOKIMIA
1. Kuman Gram Negatif (Khusus Enterobacteriaceae)
Bakteri ditanam di media KIA, LIA, MIO, SSS.
2. Kuman Gram Positif (S. aureus)
Bakteri ditanam di media MSA
IDENTIFIKASI SCR BIOKIMIA KUMAN
ENTEROBACTERIACEAE
1. Ambil ose lancip, pijarkan pada nyala api. Biar dingin dan
posisi agak dekat api.
2. Ambil bakteri dari tb.stok menggunakan ose lancip
dengan cara tutup tabung dibuka, mulut tb dilewatkan
api. Goreskan ose pada bakteri. Lewatkan lagi mulut tb
dan tutup dg kapas.
3. Ose yg berisi bakteri ditusukan pada deret media biokimia
KIA (merah), LIA, MIO, SSS) secara tegak lurus pada daerah
butt dan goreskan zig-zag pada daerah slant. Kecuali MIO
dan SSS
4. Tiap membuka dan menutup tabung, mulut tb harus
dilewatkan api.
5. Inkubasikan pada suhu 37 oC selama 24 jam.
HASIL UJI BIOKIMIA Citrobacter
Uji biokimia Klepsiela, S. Tiphy, Shigella, Salmonella
enteritidis
• KIA (Kliger Iron Agar), dalam media ini (bentuknya
miring) disamping mempelajari reaksi bakteri
terhadap komponen penyusun media juga
diperhatikan adanya produksi asam (ditandai
perubahan warna dari merah menjadi kuning), baik
pada daerah yang miring (slant) ataupun pada
tusukan (butt).
• KIA dapat dipelajari reaksi bakteri terhadap gula-
gula (laktosa dan dekstrosa). Apakah bakteri
tersebut menghasilkan asam dan gas, atau
menghasilkan asam tanpa gas, atau tidak memecah
kedua gula tersebut, apakah mempunyai
kemampuan membentuk H2S yang akan diikat
menjadi Ferri Sulfida dan akan terlihat berwarna
hitam.
 Hasil Uji KIA
Bakteri Inkubasi Hasil
waktu suhu suasana
Salmonella 18-24 35°C Aerobic Slant merah, butt kuning, butt hitam,
enterica jam H2S positif, gas positif
Escherichia coli 18-24 35°C Aerobic Slant kuning, butt kuning, H2S negatif,
jam gas positif

Pseudomonas 18-24 35°C Aerobic Slant merah, butt merah, butt hitam,
aeruginosa jam H2S positif, gas positif

Proteus 18-24 35°C Aerobic Slant merah, butt kuning, H2S positif,
mirabilis jam gas negatif
Shigella 18-24 35°C Aerobic Slanr merah, butt kuning, H2S
flexneri jam negative, gas negatif

www.themegallery.com
• SSS (Semi Solid Sucrose) Agar. Dalam media ini dapat
dipelajari:
1. motilitas (pergerakan bakteri),
2. reaksi bakteri terhadap sukrosa.
3. Disamping itu bila sukrosa diganti dengan gula yang
lain (yang diperlukan) maka dapat diketahui
kelakuan bakteri terhadap gula tersebut.
• LIA (Lysine Iron Agar). Dalam media ini dapat dilihat
kelakuan bakteri terhadap lysine dan kemampuan
membentuk H2S.

• Aktivitas bakteri terhadap lysine, yaitu apakah

bakteri dapat melakukan dekarboksilasi lisin atau
tidak dan deaminasi lisin atau tidak.

www.themegallery.com
 Hasil Uji LIA
Slant Butt indikasi
ungu kuning Tidak dekarboksilasi lisin
ungu Dekarboksilasi lisin
merah Deaminasi lisin
ungu Tidak deaminasi lisin
Endapan hitam Membentuk H2S

Bakteri Waktu Suhu Slant Butt H2S

inkubasi inkubasi
Escherichia coli 18-24 jam 33-37°C Ungu Ungu -
Proteus mirabilis 18-24 jam 33-37°C Merah Kuning -
Salmonella 18-24 jam 33-37°C Ungu Ungu +
enterica
Shigella flexneri 18-24 jam 33-37°C Ungu Kuning -
www.themegallery.com
• MIO (Motility Indol Ornithine Medium). Dalam media ini dipelajari
1. pergerakan bakteri,
2. kemampuan bakteri menghasilkan Indol,
3. reaksi pemecahan Ornithine

www.themegallery.com
MELIHAT MOTILITAS BAKTERI
Identifikasi E. coli dg media TBX
50 µL sampel pada pengenceran tertentu

inokulasi pada media TBX, ratakan

Inkubasi 18-24 jam dengan suhu 37 0C

Amati koloni yang tumbuh

Warna biru-kehijauan
(Positif E.coli)
REAKSI YANG TERJADI
Koloni E. coli di media TBX
IDENTIFIKASI KUMAN GRAM POSITIF (S. aureus)
1. Ambil ose lancip, pijarkan pada nyala api. Biar dingin dan posisi
agak dekat api.
2. Ambil bakteri dari tb.stok bakteri S. aureus menggunakan ose
lancip dengan cara tutup tabung dibuka, mulut tb dilewatkan
api. Goreskan ose pada bakteri. Lewatkan lagi mulut tb dan
tutup dg kapas.
3. Ose yg berisi bakteri digoreskan pada media MSA.
4. Tiap membuka dan menutup tabung, mulut tb harus
dilewatkan api.
5. Inkubasikan tb pada suhu 37 C selama 24 jam. Amati
perubahan warna yang terjadi.
UJI BIOKIMIA BAKTERI S. aureus
Mannitol Salt Agar (MSA)
mengandung senyawa
karbohidrat berupa mannitol dan
indicator fenol merah. Fenol
merah adalah indicator pH untuk
mendeteksi asam yang dihasilkan
dari fermentasi mannitol pada
Staphylococcus aureus