Nama : Juliani Dwi Krismawati

Kelas : 2C 1

NIM : 19011110

PEWARNAAN BAKTERI

I. Tujuan
1. Untuk memahami cara mengidentifikasi bakteri secara gram.
2. Membagi bakteri menjadi bakteri gram negatif (-) dan bakteri gram positif (+).
3. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar.

II. Landasan Teori

a. Bakteri dan jenisnya
1. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap
warna violet dan mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal. Bakteri
umumnya berbentuk 1-sel atau sel tunggal atau uniseluler, tidak
mempunyai klorofil berkembangbiak dengan pembelahan sel atau
biner.Karena tidak mempunyai klorofil, bakteri hidup sebagai jasad yang
saprofitik ataupun sebagai jasad yang parasitik.Tempat hidupnya tersebar
di mana-mana, yaitu di udara, di dalam tanah, didalam air, pada bahan-
bahan, pada tanaman ataupun pada tubuh manusia atau hewan. Contoh
bakteri gram positif itu sendiri ialah Bifidobacterium, Lactobacillus,
Staphilococcus, Clotridium, Actinomyces, Arachnia, Propionibacterium
dan Peptostreptococcus.

2. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap
warna merah dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Lapisan
peptidoglikan pada bakteri Gram negative terletak di ruang periplasmik
antara membrane plasma dengan membrane luar. Contoh bakteri gram
negatif ialah aeruginosa, azotobacter, influenza, rhizobium
leguminosarum, salmonella typhi, helicobacter pylori, neisseria
gonorrchoeae, pseudomonas aeruginosa.

3. Bakteri Tahan Asam (BTA)

Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri –
ciri berantai karbon ( C )  yang panjangnya 8 – 95 dan memiliki dinding
sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid
yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk
 BTA antara lain Mycobacterium Tuberculosis, Mycobacterium Bovis,
Mycobacterium Leprae, Nocandia Menigitis, dan Nocandia Gonoerrhoae.
Mycobacteruim Tuberculosis adalah bakteri pathogen yang dapat
menyebabkan penyakit Tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga
digolongkan sebagai Bakteri Tahan Asam (BTA). Penularan
Mycobacterium Tuberculose terjadi melalui jalan pernapasan.

b. Pewarnaan gram
Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang penting untuk
identifikasi bakteri. Teknik pewarnaan ini termasuk differential stain atau
pewarnaan bertingkat yang menggunakan lebih dari satu jenis pewarna. Teknik
pewarnaan Gram didasarkan atas perbedaan struktur dinding sel kedua jenis
bakteri tersebut. Dinding sel bakteri Gram-positif hanya terdiri dari satu lapisan
tebal yang tersusun dari satu jenis molekul saja. Sementara itu Gram-negatif
memiliki dua lapis dinding sel, yaitu lapisan peptidoglikan yang relatif lebih tipis
dan membran luar. Dinding sel Gram-positif 90 % nya merupakan peptidoglikan
sedangkan hanya 10-20 % dinding sel bakteri Gram-negatif yang tersusun atas
peptidoglikan, sisanya merupakan polisakarida, lipid, dan protein yang menyusun
membran luar. Oleh karena itu membran luar disebut juga sebagai lapisan
lipopolisakarida (LPS).

c. Prinsip pewarnaan gram

Pada tahap pertama pewarnaan Gram, kompleks kristal violet-iodine yang bersifat
insoluble akan terbentuk. Setelah penambahan alkohol, kompleks kristal ini akan
terekstraksi pada bakteri Gram-negatif namun tidak pada Gram-positif. Hal ini
terjadi karena Gram-positif memiliki dinding sel peptidoglikan yang sangat tebal,
sehingga ketika didehidrasi dengan alkohol pori dinding sel akan menutup dan
menjaga kompleks kristal violet-iodine tetap di dalam sel. Sementara itu pada
Gram-negatif, alkohol dapat dengan mudah memasuki membran luar yang
didominasi lipid dan mengekstraksi kompleks kristal tersebut. Setelah
dekolorisasi dengan alkohol, bakteri Gram negatif akan terlihat bening. Oleh
karena itu perlu dilakukan pewarnaan kembali dengan pewarna kedua yakni
safranin.

d. Analisis hasil
Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan
karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri
gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan
alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna
air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini
disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
III. Prinsip Reaksi
MSDS : https://www.merckmillipore.com/ID/id/product/msds/MDA_CHEM-101603?
Origin=PDP

IV. Alat dan Bahan

1. Biakan kultur bakteri
2. Kaca objek
3. Bunsen
4. Jarum ose
5. Penjepit kayu
6. Korek api
7. Rak pewarnaan
8. Larutan Kristal violet (pewana primer)
9. Larutan iodine/lugol (mordant)
10. Alcohol 95% (zat dekolorisasi)
11. Safranin (pewarna tandingan)
12. Pipet tetes yang berbeda untuk setiap larutan
13. Aquadest

V. Prosedur Kerja
1. Gram postif
 Persiapan preparat :
1. Nyalakan Bunsen.
2. Ambil dan bersihkan kaca preparat.
3. Ambil penjepit kayu dan jepitkan pada kaca objek.
4. Lakukan pemanaan pada kaca preparat dengancara dilalui api kecil.
 5. Ambil dan bakar jarum ose pada api Bunsen hingga terlihat membara agar
siap digunakan.
6. Teteskan aquadest pada ose.
7. Letakkan tetesan tersebut ditengah kaca objek.
8. Panaskan kembali ose hingga membara.
9. Siapkan isolate pada media kultur nutrient agar, sebelumnya lalui tepian
cawan petri pada api sebelum membuka cawan.
10. Isolate diambil perlahan dalam jumlah sedikit menggunakan ose yang
sebelumnya sudah dibakar. (Jangan menggunakan ose saat masih panas).
11. Oleskan isolate yang terambil pada bagian tengah yang sebelumnya
ditetesi aquadest dan kemudian ratakan dengan menggunakna ose.
12. Bakar kembali ose hingga membaralakukan tahapan fiksasi secara berhati-
hati dengan cara kaca objek dilalui oleh api.

 Pewarnaan (staining) :
1. Ambil larutan Kristal violet menggunakan pipet tetes.
2. Lalu teteskan disebaran bakteri dan kaca objek dan biarkan selama 1
menit.
3. Setelah satu menit, bersihkan menggunakan aquadest.
4. Tambahkan larutan lugol dan biarkan selama 1 menit.
5. Bersihkan juga menggunakan aquadest.
6. Setelah itu proses dekolorisasi menggunakan larutan alcohol 95%.
7. Teteskan alcohol selama 5 detik dan segera bilas menggunakan aquadest.
8. Teteskan safranin sebagai pewarna tanding dan biarkan selama satu menit.
9. Cuci lagi menggunakan aquadest.
10. Setelah pewarnaan selesai, lakukan pengeringan di atas slide dryer.
11. Setelah kering barulah kita dapat melakukan pengamatan dengan
mikroskop.

 Pengamatan :
1. Siapkan preparat yang siap diamati.
2. Tetesi preparat dengan menggunakan minyak emersi sebanyak 1 tetes
(perbesar 10x100).
3. Letakkan preparat pada meja preparat mikroskop dan lakukan pengamatan
dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x100 pada lensa objektif.

2. Gram negative
 Persiapan preparat :
1. Nyalakan Bunsen.
2. Ambil dan bersihkan kaca preparat.
3. Ambil penjepit kayu dan jepitkan pada kaca objek.
4. Lakukan pemanaan pada kaca preparat dengancara dilalui api kecil.
5. Ambil dan bakar jarum ose pada api Bunsen hingga terlihat membara
agar siap digunakan.
6. Teteskan aquadest pada ose.
7. Letakkan tetesan tersebut ditengah kaca objek.
8. Panaskan kembali ose hingga membara.
9. Siapkan isolate pada media kultur nutrient agar, sebelumnya lalui tepian
cawan petri pada api sebelum membuka cawan.
10. Isolate diambil perlahan dalam jumlah sedikit menggunakan ose yang
sebelumnya sudah dibakar. (Jangan menggunakan ose saat masih panas).
11. Oleskan isolate yang terambil pada bagian tengah yang sebelumnya
ditetesi aquadest dan kemudian ratakan dengan menggunakna ose.
12. Bakar kembali ose hingga membaralakukan tahapan fiksasi secara
berhati-hati dengan cara kaca objek dilalui oleh api.

 Pewarnaan (staining) :
1. Ambil larutan Kristal violet menggunakan pipet tetes.
2. Lalu teteskan disebaran bakteri dan kaca objek dan biarkan selama 1
menit.
3. Setelah satu menit, bersihkan menggunakan aquadest.
4. Tambahkan larutan lugol dan biarkan selama 1 menit.
5. Bersihkan juga menggunakan aquadest.
6. Setelah itu proses dekolorisasi menggunakan larutan alcohol 95%.
7. Teteskan alcohol selama 5 detik dan segera bilas menggunakan aquadest.
8. Teteskan safranin sebagai pewarna tanding dan biarkan selama satu menit.
9. Cuci lagi menggunakan aquadest.
10. Setelah pewarnaan selesai, lakukan pengeringan di atas slide dryer.
11. Setelah kering barulah kita dapat melakukan pengamatan dengan
mikroskop.

 Pengamatan :
1. Siapkan preparat yang siap diamati.
2. Tetesi preparat dengan menggunakan minyak emersi sebanyak 1 tetes
(perbesar 10x100).
3. Letakkan preparat pada meja preparat mikroskop dan lakukan pengamatan
dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x100 pada lensa objektif.
 3. BTA
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Pakailah masker
4. Diambil satu ose sputum pada bagian yang kasar dan sapukan secara merata
(lingkaran-lingkaran kecil) dan tebal pada obyek gelas yang bersih,sesuai
dengan pola oval.
5. Keringkan pada udara terbuka dan fiksasi.
6. Diletakkan obyek gelas mendatar pada rak tabung pewarnaan dan tetesi
larutan carbol fuchsin 0,3%, panaskan bian bawah kaca dengan cara
melakukan sebentar 3 kali hingga cairan pewarnan mengeluarkan uap lalu
biarkan 5 menit.
7. Dibuang zat warna dan cuci dengan air mengalir.
8. Dilunturkan zat warna dengan alkohol asam sampai zat warna semua larut.
Kemudian dicuci dengan air mengalir.
9. Dituangi dengan larutan metilen biru 0,3%, biarkan selama 3 menit. Cuci
dengan air mengalir dan keringkan dengan kertas saring.
10. Dilihat dengan mikroskop dengan perbesaran 100 kali serta tambahan
oil imersi dan gambarkan morfologi serta tuliskan bentuk dan sifat pewarnaan
dari sel bakterii serta latar belakang sel bakteri.

VI. Daftar Pustaka

https://www.slideshare.net/IrfanBayuRamadhan/pewarnaan-gram
http://microbiologyl.blogspot.com/2012/08/pewarnaan-gram.html

https://www.dosenpendidikan.co.id/bakteri-gram-positif-dan-negatif/

https://www.generasibiologi.com/2018/04/prinsip-dan-prosedur-kerja-pewarnaan-
gram.html

http://dwihryni.blogspot.com/2017/05/laporan-praktikum-pewarnaan-gram.html

http://deeresnewbie.blogspot.com/2019/06/makalah-pewarnaan-bta-ii-
mikrobologi.html

https://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram