Prosedur Praktikum Mikrobiologi

Kelompok 2

A. Pewarnaan Gram
 Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram.
 Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna
merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram potif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Sel
bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama.Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek (Fitria, 2009).

Alat dan bahan :

1. Kawat ose 9. Biakan murni

2. Spiritus 10. Aquades steril
3. Kaca preparat 11. Alkohol 96%
4. Pipet tetes 12. Larutan kristal violet
5. Korek api 13. Larutan safranin
6. Mikroskop 14. Minyak imersi
7. Beaker Glass 15. Larutan lugol
8. Tabung reaksi 16. Kaca Objek
Prosedur :
 Pewarnaan Gram
1. Disiapkan preparat sampel dengan dibersihkan kaca preparat dan cover glass
menggunakan alkohol sampai bebas lemak dan debu.
2. Diambil kultur bakteri dalam medium cair dengan pipet dengan ditetesi diatas kaca
preparat ± 3 tetes dan biarkan agak mengering.
3. Difiksasi dengan cara melewatkan kaca preparat diatas nyala api sampai mengering.
4. Diberikan pewarnaan 1 Violet Kristal 2-3 tetes. Pewarna Kristal violet ini berguna
sebagai indicator bakteri gram positif.
5. Didiamkan + 1 menit.
6. Dibilas dengan air mengalir.
7. Diberikan larutan lugol / yodium, biarkan + 1 menit. Pemberian gram iodium (lugol)
berfungsi sebagai pembentuk kompleks ungu Kristal-yodium (UK-Y).
8. Dicuci kembali, setelah dicuci dikering anginkan.
9. Diberi alkohol 95%, biarkan 10-20 detik. Pemberian alkohol berfungsi untuk
menghilangkan warna pada gelas objek sampai warna tidak luntur lagi.
10. Dicuci sebentar.
11. Diberi larutan warna 2 ( Safranin), selama 10-20 detik. Pewarnaan dengan larutan
safranin berfungsi sebagai indicator bakteri gram negatif ataupun positif.
12. Bilas dengan air, keringkan dengan kertas serap/ tissue.
13. Periksa dibawah mikroskop dengan diberi minyak imersi.

 Pewarnaan Gram Positif

1. Dibersihkan object glass dengan kapas.
2. Dituliskan kode atau nama bakteri pada sudut object glass.
3. Jika menggunakan biakan cair : dipindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat
juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Biakan dikocok.
4. Jika menggunakan biakan padat : dipindahkan bakteri dengan jarum inokulum, satu
ulasan saja kemudian diberi aquades dan disebarkan pada object glass hingga sel merata.
5. Dikeringkan ulasan sambil difiksasi dengan api bunsen (dilewatkan diatas api 2 - 3 kali)
6. Ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan methylen blue, safranin, crystal violet) dan
tunggu kurang lebih 30 detik.
7. Dicuci dengan aquades kemudian dikeringkan dengan tissue.
8. Diamati dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).

 Pewarnaan Gram Negatif

1. Diambil dua object glass, diteteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu
object glass.
2. Diambil biakan lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, dan
dicampurkan.
 3. Ditempelkan sisi object glass yang lain kemudian digesekkan ke samping kiri.
4. Dibiarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan diatas api.

B. Pewarnaan Spora Pada Bakteri

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap
pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba,
sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana
kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak
menguntungkan (dwidjoseputro,1989)

Alat dan bahan :

1. Cawan petri
2. Kaca objek
3. Kapas
4. Kertas saring
5. Korek api
6. Mikroskop
7. Kawat ose
8. Spiritus
9. Spidol merah
10. Tabung reaksi
11. Waterbath
12. Aquadest
13. Desinfektan
14. Alkohol 70%
15. Zat warna karbolfuksin
16. Zat warna metilen blue
Prosedur :

1. Dibuat suspensi bakteri yang akan diuji

2. Ditambahkan karbolfuksin sebanyak 1:1 kedalam suspensi tersebut
3. Kaca objek disterilisasi dengan cara dicuci
4. Dimasukkan kedalam larutan desinfektan
5. Dimasukkan kedalam alcohol 70%, dan lap menggunakan kapas sampai berdecit
6. Lingkari bagian bawah kaca objek dengan spidol sebagai area untuk pengolesan sampel
bakteri
7. Ose difiksasi dengan cara dibakar dengan spiritus sampai berpijar
8. Dan didinginkan dengan cara didekatkan dengan spiritus
9. Dibuat olesan dari campuran suspensi dan digenangi dengan asam sulfat 1% selama
dettik
10. Dicuci dan dibilas dengan aquadest
11. Kemudian olesan tersebut digenangi dengan pewarna tandingan metilen blue selama 5
menit, buang zat warna yang berlebih dan bilas dengan aquadest dan dikeringkan dengan
kertas saring
12. Olesan ditetesi minyak imersi lalu diperiksa dibawah mikroskop

C. Pewarnaan Flagel

Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Flagella mengakibatkan bakteri dapat bergerak,
berputar. Penyusun flagella adalah sub unit protein yang disebut flagelin, yang membpunyai
berat molekul rendah berdasarkan jumlah dan letak flagelanya bakteri dibedakan menjadi
monotorik, lapotrik, amfitrik, peritrik, dan atrik. Prinsip pewarnaan flagella adalah membuat
organel tersebut dapat dilihat dengan cara melapisinya dengan larutan mordant dalam jumlah
yang cukup. Ada dua metode pada pewarnaan flagella yaitu metode gray dan metode leifson.
Metode gray digunakan untuk mendapatkan hasil yang lebih baik dan mengena walaupun dalam
metode ini tidak dilakukan pencelupan khusus.

Interpretasi hasil

1. Metode Gray : flagella dan bakteri berwarna merah

2. Metode Leifson : flagella dan bakteri berwarna merah

Alat :

1. Objek glas 7. Rak tabung

2. Pipet tetes
3. Bunsen
4. Mikroskop
5. Kertas lensa
6. Tisu
Bahan :

 Metode gray
a. Larutan mordant atau pemantik
1. Larutan jenuh potasium alum atau KAI (SO4)2 5 ml
2. Asam tonat 20% dalam air 2ml
3. Merkuri klorida jenuh dalam air 2 ml campurkan hingga homogeny
4. Larutan jenuh fuchsin dalam alcohol 0,4 ml
b. Carbol fuchsin (ZNA)
c. Minyak imersi
d. Kultur bakteri
 Metode leifson
a. Larutan leifson A
1. Fuchsin 0,5 gram
2. Alcohol 95% 50 ml
b. Larutan leifson B
1. Tannic acid 1,5 gram
2. Zodium clorid 0,75 gram
3. Aquadest 100 ml
c. Minyak imersi
d. Kulur bakteri

Prosedur :

 Metode Gray
1. Disiapkaan objek glas yang bersih dan bebas lemak
2. Diteteskan satu tetes kultur bakteri atau suspense bakteri pada salah satu ujung objek
glas, tegakkan pada rak sehingga terjadi aliran kebawah, biarkan kering diudara
3. Digenangi dengan larutan mordant. Diamkan selama 5-15 menit
4. Cat dibuang dan dibilas dengan air mengalir
5. Digenangi dengan carbol fuchsin atau (zat NA) diamkan 5-10 menit
6. Cat dibuang dan dibilas dengan air mengalir dan biarkan kering
7. Diperiksa dibawah mikroskop menggunakan objektif 100X dan minyak imersi
 Metode Leifson
1. Disiapkan objek glas yang bersih dan bebas lemak
2. Diteteskan satu tetes kultur bakteri atau suspense bakteri pada salah satu ujung objek
glas. Tegakkan pad arak sehingga terjadi aliran kebawah, biarkan kering diudara
3. Digenangi dengan campuran cat A dan B , diamkan selama 5 menit sampai terlihaat
warna kehijauan pada tepi tetesan
4. Cat dibuang dan dibilas dengan air mengalir biarkan sampai kering
5. Dilihat dibawah mikroskop menggunakan perbesaran 100X dan minyak imersi