Metode-Metode Pewarnaan yang

Digunakan di Laboratorium
Mikrobiologi

DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI FK
USU
Referensi:
Microbiology: a laboratory manual, 7th ed.
Cappuccino, Sherman. Pearson Benj. Cummings.
Mikrobiologi Kedokteran FK UI.
Baker F, Silverton RE, Introduction to Medical
Laboratory Technology, 5th Ed. The English
Language Book Society, London 1982.
Crnickshank R. Medical Microbiology, 11 th Ed.
The English Language Book Society, Great
Britain
 Specific Learning Objectives

1. Menjelaskan metode pewarnaan bakteri

2. Menjelaskan metode pewarnaan jamur

 Pewarnaan Bakteri
Bakteri  Transparan, Morfologi sulit dilihat

Pewarnaan  morfologi bakteri mudah dilihat

Mikroskop  ukuran, bentuk, susunan dan beberapa

struktur lain

identifikasi bakteri
1. Pewarnaan sederhana
2. Pewarnaan diferensial
- Pewarnaan gram
- Pewarnaan tahan asam
3. Pewarnaan khusus
- Pewarnaan endospora
- Pewarnaan kapsul
- Pewarnaan flagella
Prosedur pembuatan hapusan bakteri (fiksasi)

1. Bersihkan gelas objek agar tidak

berlemak, layang kan diatas nyala api
2. Beri label dengan pensil kaca atau spidol
3. Teteskan satu tetes aquadest atau garam
faal pada gelas objek
4. Ambil bahan pemeriksaan klinik (koloni)
yang hendak diwarnai dengan
menggunakan sengkelit/ose steril
5. Suspensikan sediaan tersebut pada tetesan
aquadest pada gelas objek lalu sebarkan
dengan gerakan memutar agar rata. Luas
sediaan 1-2 cm2
6. Sediaan dibiarkan mengering di udara
7. Lewatkan diatas nyala api bunsen/spiritus
sebanyak 3 kali agar sediaan melekat
Heat Fixation
 1. Pewarnaan sederhana

Satu macam zat pewarna (single dye)

methylen blue, crystal violet, safranin atau
carbol fuchsin

Memberikan informasi berupa:

- morfologi
- susunan sel
Cell Arrangements:
Prosedur pewarnaan sederhana (simple
staining)

1. Lakukan fiksasi dari sediaan (berasal dari

koloni atau dari bahan pemeriksaan klinik)
2. Genangi dengan zat warna methylen blue
selama 30-60 detik
3. Bilas dengan air mengalir
4. Keringkan di udara
5. Sediaan siap untuk dilihat dibawah
mikroskop
2. Pewarnaan diferensial
 Pewarnaan Gram
Dr Hans Christian Gram (1884)
Bakteri dibedakan dalam 2 golongan:
1. Bakteri gram positif : ungu
2. Bakteri gram negatif : merah

Berdasarkan komposisi kimiawi dinding

sel bakteri
 Karakteristik perbedaan dinding sel bakteri
gram positif dan gram negatif
Gram-positive cell walls
 Thick peptidoglycan
(90%)
 Teichoic acids
 1 layer (satu lapis)
 Not many polysaccharides
 In acid-fast cells, contains
mycolic acid
Gram-negative cell walls
• Thin peptidoglycan (5-
10% )
• No teichoic acids
• 3 layers (3 lapis)
• Outer membrane has lipids,
polysaccharides
• No acid- fast cells (mycolic
acid)
Metode pewarnaan gram
Hasil pewarnaan Gram (gbr diganti)

Gram positive coccus Gram negative

bacilli
Staphylococcus Spp E.coli
Hasil pewarnaan Gram

Staphylococcus

Gonococcus
Gram positive bacteria
1. Cocci/bulat
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Streptococcus pneumoniae
- Gafkya tetragena
- Sarcina lutea

2. Rods/basil :
- Clostridium tetani
- Clostridium botulinum
- Bacillus anthracis
- Bacillus subtilis
- Corynebacterium diphteriae
- Bacillus cereus
Gram negative bacteria
1. Cocci
- Neisseria gonorrhoeae
- Neisseria meningitidis

2. Rods/basil
- Escherichia coli
- Salmonella thyposa
- Shygella dysentriae
- Klebsiella pneumonia
- Proteus vulgaris
- Haemophylus influenzae
- Pseudomonas aeruginosa
- Enterobacter cloacae
3. Coma
- Vibrio cholerae
- Vibrio parahaemolyticus
4. Spiral
- Campylobacter jejuni
- Helicobacter pylori
Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) :
Mycobacterium

 Umumnya bakteri dapat diwarnai dengan

pewarnaan gram
 Mycobacterium sp.
- Tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan
gram
- Harus dengan pewarnaan tahan asam
 Sekali mengikat zat warna carbol fuchsin(merah)
maka akan mempertahankan warna tersebut
walaupun dilunturkan dengan acid alkohol

 Pewarnaan :
• Ziehl Neelsen (WHO)
3. Pewarnaan BTA Metode
Ziehl Neelsen
Pewarnaan BTA
1. Bersihkan gelas objek dengan kain bersih
agar tidak berlemak, gelas objek
dilayangkan di atas nyala api.
2. Dinginkan gelas objek dan beri
tanda/label dengan pensil kaca/spidol
3. Ose/sengkelit dipijarkan dan setelah
dingin dipakai mengambil sediaan sputum
yang akan diwarnai lalu disebarkan rata
seluas 1-2 cm².
Pewarnaan BTA
Jangan lupa memijarkan kembali ose yang
telah digunakan mengambil sediaan yang
mengandung bakteri tadi.
4. Biarkan sediaan mengering di udara,
kemudian lewatkan di atas nyala api
sebanyak 3 kali agar sediaan melekat
dengan sempurna di atas permukaan gelas
objek (bagian yang berisi sediaan jangan
terkena nyala api, jadi menghadap ke atas)
Pewarnaan BTA
5. Genangi dengan larutan carbol fuchsin
selama 5 menit
6. Panaskan di atas nyala api sampai
menguap, jangan mendidih atau kering,
diamkan selama 5 menit
7. Cuci dengan air kran 5 detik
8. Lunturkan dengan HCl alkohol sehingga
tak ada lagi zat warna yang luntur
9. Cuci dengan air kran 5 detik
Pewarnaan BTA
10. Genangi dengan methylen blue selama
30 detik
11. Cuci dengan air kran dan keringkan.
Preparat siap untuk diperiksa di bawah
mikroskop
 1 2 3

Letakkan sediaan dgn bagian Panaskan sediaan dengan

hapusan menghadap keatas Genangi seluruh permukaan sulut api sampai menguap,
diatas rak pewarnaan dengan Carbol fuchsin diamkan 5 menit

4 5

Genangi dengan asam alkohol

Bilas sediaan dengan air mengalir (dekolorisasi)
 6 7

Bilas sediaan dengan air mengalir genangi permukaan sediaan dengan methylene
blue 10-20 detik ( counterstaining)

8
9

bilas sediaan dengan air mengalir Keringkan sediaan pada rak pengering
Mycobacterium tuberculosis
Pewarnaan Bakteri Tahan Asam
Metode : Auramine Stain
Dengan : Fluorescence Microscopy
Diperlukan:
Solution I (Staining Solution)
Auramine 0.3 g
Phenol Crystals 3.0 g
Distilled water 97.0 ml
Solution 2 (Decolorizer)
Sodium Chloride 0.5 g
Hydrochloric acid 0.5 ml
Ethyl Alcohol, 75% 100.0 ml
Solution 3 (Counterstain)
Potassium Permanganate 0.1% solution
 
Pewarnaan BTA Metode Auramine
Cara:
Buat sediaan sputum, biarkan kering dan fiksasi dengan
pemanasan secara perlahan-lahan
Lumuri solution 1 selama 1 menit
Cuci dengan air kran
Lumuri solution 2 selama 5 menit
Cuci dengan air kran secara perlahan
Lumuri solution 3 selama 30 sekon
Cuci dengan air kran secara perlahan biarkan kering, jangan
diblot
Periksa dengan mikroskop fluorescence
Hasil: BTA = batang kuning terang berluminasi, dengan
warna dasar gelap
 Pewarnaan spora
metode Schaeffer-fulton
 Spore: hijau
 Vegetative cell: merah
 Pewarnaan spora menurut Schaeffer
Fulton
1. Siapkan sediaan yang terfiksasi
2. Genangi dengan larutan MALACHITE
GREEN 5%. Panaskan perlahan-lahan,tapi
jangan sampai mengering
3. Bilas dengan air keran
4. Genangi dengan SAFRANIN
5. Bilas dengan air keran
6. Keringkan
Pewarnaan kapsul
Metode Gins Burri
Metode Welch
Metode Hiss
Metode Muir
 Pewarnaan flagella

• Flagella terlalu halus jika dilihat dengan

menggunakan mikroskop cahaya.
• Metode:
 pewarnaan Gray
pewarnaan Leifson
 pewarnaan Leifson dimodifikasi
Metode pewarnaan Gray
dengan memberikan suspensi koloid dari tannic
acid salt yang akan mengendap pada flagella
sehingga diameter flagella lebih besar dan
kemudian diwarnai dengan carbolfuchsin ,
flagella dapat dilihat dengan mikroskop cahaya.
PEWARNAAN TERHADAP
CORYNEBACTERIUM DAN
METACHROMATIC GRANULES
 Metode : Neisser
 Diperlukan Larutan:
Neisser’s Methylene Blot Stain
Methylene Blue 1g
Ethyl Alcohol (95 percent) 50 ml
Glacial Acetic Acid 50 ml
Distilled Water 1000 ml
 
PEWARNAAN TERHADAP
CORYNEBACTERIUM DAN
METACHROMATIC GRANULES
Cara:
Lumuri sediaan dengan larutan Neisser Methylene
Blue selama 3 menit
Cuci dengan larutan iodine encer (larutan 1:10 dalam
air) biarkan selama 1 menit
Bilas dengan air
Lumuri dengan larutan neutral red selama 3 menit
sebagai counter stain
Bilas dengan air dan keringkan

Hasil: Granules berwarna biru pekat

Bakteri berwarna pink
PEWARNAAN TERHADAP
CORYNEBACTERIA
Metode: Albert
Diperlukan:
Larutan I: Tuloidine Blue 1.5 g
Malachite Green2.0 g
Acetic Acid Glacial 10.0 ml
Ethyl Alcohol, 95 percent 20.0 ml
Distilled Water 1000.0 ml
 Larutan 2:
Iodine 6g
Potasium Iodide 9 g
Distilled water 900 ml
 
 PEWARNAAN TERHADAP
CORYNEBACTERIA
Cara:
Buat sediaan, biarkan kering dan fiksasi dengan pemanasan
secara perlahan-lahan (biasanya sediaan diambil dari biakan
18-24 jam dalam Loffler serum culture)
Lumuri larutan 1 selama 3-5 menit
Bilas dengan air dan keringkan hati-hati dengan cara blot
Lumuri larutan 2 selama 1 menit
Cuci dengan air, keringkan dengan cara blot dan keringkan
dengan pemanasan secara perlahan-lahan
Hasil: Granules biru kehitaman, bakterinya hijau
Bakteri lain berwarna hijau pucat