PEMERIKSAAN

LABORATORIUM
DALAM DIAGNOSIS
HEMOFILIA
Muhammad Nazarudin
 Pendahuluan
Hemofilia
• Kelainan herediter berupa gangguan pembekuan
darah, ditandai dengan manifestasi perdarahan,
disebabkan oleh kelainan atau defisiensi faktor
koagulasi.
• Macam-macam hemofilia :
- hemofilia A : def. FVIII
- hemofilia B : def. FIX
- hemofilia C : def. FXI
-acquired hemophilia : karena adanya antibodi
terhadap FVIII (tanpa ada defisiensi FVIII) 2
Pola pewarisan hemofilia (A dan
B)

Gambar . Skema transfer gen hemofilia dari ibu karier dan bapak menderita
hemofilia (Mansouritorghabeh, 2015).
Gambar. Skema pewarisan gen hemofilia dari bapak hemofilia dengan ibu karier
(Mansouritorghabeh, 2015).
 Faktor koagulasi VIII
(FVIII)
• Merupakan glikoprotein
• Dikode oleh gen 186.000 bp
• Protein faktor VIII dibagi menjadi:
• Rantai berat (A1-A2-B)
• Rantai ringan (A3-C1-C2)
• Bentuk aktif FVIII mengandung glycosylated sites-free
domain B  as. Amino Arg740 untuk Glu1649.
• FVIII: C  membentuk kompleks dengan von
Willebrand (vWF).
• Waktu paruh F VIII:
• Dengan vWF: 12 jam
• Tanpa vWF: 2 jam
Perbandingan Faktor VIII dengan
vWF
Rentang normal F VIII yaitu berkisar 50%-150%
dari nilai normal (bervariasi sesuai umur)

FVIII meningkat pada keadaan (Williamson et al., 2011):

• Status inflamasi sebagai reaktan fase akut
• Penggunaan kontrasepsi oral
• Kehamilan trimester terakhir
FVIII menurun pada keadaan (Williamson et al., 2011):
• Hemofilia A
• Disseminated intravascular coagulation (DIC)
• Acquired factor VIII inhibitor
• Von willebrand disease
• Beberpa wanita karier gen hemofilia (ringan)
 Faktor Koagulasi IX
(FIX)
• Protein yg tergantung Vit. K, dlm bentuk zymogen
yg tdk aktif
• Aktivitasnya berlangsung pada membran fosfolipid,
diawali dengan membentuk komplek dg faktor
jaringan (TF/VIIa)
• Rentang normal: 70%-120% dari nilai normal
Peningkatan FIX terjadi pada:
• Kehamilan
• Penggunaan kontrasepsi oral
Penurunan FIX terjadi pada keadaan:
• Hemofilia B
• Penyakit hati
• Penggunaan antagonis vitamin K (warfarin) atau
defisiensi vitamin K
• Amyloidosis
• Syndrome nefrotik
• Alloantibodi pada hemofilia B yang diterapi dengan infus
faktor IX
• Autoantibodi terhadap faktor IX pada individu yang
sebelumnya sehat (sangat jarang)
Kaskade
koagulasi
Hemofilia
A
• Defisiensi faktor VIII  80% dari kasus hemofilia
• Gangguang X-linked

Inversi (± 50%)

Mutasi titik KadarFVIII

sangat rendah
insersi

delesi
Hemofilia
B
• Defisiensi FIX
• Abnormalitas dari gen FIX pada kromosom X:
• Delesi (besar atau kecil)
• Mutasi titik
• Mutasi missense
 Differential
diagnosis
• Hemofilia:
• Hemofilia B
• Kelainan koagulasi kongeninal lainnya: defisiensi FXI dan FXII
• Von Willebrand disease
• Aquired inhibitor FVIII
• Kombinasi defisiensi kongenital FVIII dan FV
• Hemofilia B:
• Hemofilia A
• Defisiensi faktor koagulasi tergantung vit. K (didapat/
diturunkan)
• Penyakit hati
• Overdosis warfarin
 Tabel. Klasifikasi klinis hemofilia A dan hemofilia B berdasarkan
faktor
kadar
Klasifikasi
koagulasi. Hemofilia A Hermofilia B Gambaran klinis
Kadar faktor Kadar faktor
VIII IX
Severe ≤ 1% dari ≤ 1% dari 1. Spontaneous hemorrhage
(berat) normal normal from early infancy
(≤0.01 U/ml) (≤0.01 U/ml) 2. Frequent spontaneous
hemarthroses and other
hemorrhages requiring
clotting factor
replacement.
Moderat 1-5% dari 1-5% dari 1. Hemorrhage secondary to
(sedang) normal normal trauma or surgery
(0.01-0.05 (0.01-0.05 2. Occasional spontaneous
U/ml) U/ml) hemarthroses
Mild 6-30% dari 6-30% dari 1. Hemorrhage secondary to
(ringan) normal normal trauma or surgery
(0.06-0.30 (0.06-0.40 2. Rare spontaneous
U/ml) U/ml) hemorrhage
Dikutip dari: Williams Manual of Hematology, sixth edition. 2003 (Lichtman et al., 2003).
 Diagnosis dan pemeriksaan laboratorium
pada hemofilia
Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan
hemofilia dilakukan pada (Kitchen and McCraw,
2000):
• Bayi laki-laki, riwayat keluarga (+), dengan atau tanpa
gejala
• Remaja atau dewasa asimtomatik  perdarahan yang
berlebihan pada saat trauma atau tindakan.
• Individu asimtomatik  pemanjangan APTT.

Diagnosis pasti hemofilia:

• Assay kadar FVIII atau IX
• Assay cytogenetic
 Algoritme diagnosis laboratorik
hemofilia
Pemeriksaan penyaring
hemostasis

APTT memanjang PPT normal

APTT dari campuran plasma pasien dan plasma normal

Terkoreksi Tidak
terkoreksi

Tes substitusi Inhibitor

Asai faktor
 Pemeriksaan yang mendukung diagnosis
hemofilia:

Pemeriksaan penyaring: CT, PT, APTT

Mixing test

Differential APTT

Pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX

Pemeriksaan inhibitor FVIII atau FIX

 1. Pemeriksaan penyaring
hemostasis:
1. Masa pembekuan (clotting time): melihat
defisiensi FVIII dan FIX
2. Masa prothrombin plasma (prothrombin time/
PT): Jalur ekstrinsik dan jalur bersama (Faktor II,
V, VII, X)  memanjang jika 10% dibawah normal
3. Masa tromboplastin partial teraktivasi (activated
partial thromboplastin time/ APTT): defisiensi
jalur intrinsik, terutama FVIII memanjang jika
FVIII < 25%
 2. Mixing
test
• Membedakan defisiensi faktor koagulasi
Tujua
dengan adanya inhibitor.
n

• Dilakukan dengan mencampur plasma

Metode pasien dengan plasma normal dengan
perbandingan 1:1, kemudian diinkubasi.

• APTT memanjang inhibitor faktor VIII

Interpretasi • Koreksi APTT  defisiensi atau tidak
menyingkirkan inhibitor apabila klinis sesuai
 3. Differential
APTT
Tujuan: untuk menentukan jenis defisiensi faktor
sebelum assay faktor
200 µL
200 µL aged
adsorbed
plasma
plasma
200 µL plasma
pasien

Masing-masing
dilakukan
pemeriksaan APTT

Skema pemeriksaan differential APTT

 Tabel Interpretasi pemeriksaan differential
APTT
Plasma normal Adsorbed plasma Aged plasma Kelainan
(F I,V,VIII,XI,XII) (F II,VII,IX,X,XI,XII)

Terkoreksi Terkoreksi Tidak terkoreksi < FVIII

Terkoreksi Tidak terkoreksi Terkoreksi < FIX

Terkoreksi Terkoreksi Terkoreksi < FXI,XII

Tidak Tidak terkoreksi Tidak terkoreksi Inhibitor

terkoreksi
 4. Pemeriksaan FVIII atau
FIX
• Tujuan pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX:
1. Menegakkan diagnosis defisiensi faktor
2. Menilai beratnya gangguan/defisiensi
3. Monitor terapi pengganti
4. Mendeteksi karier
Metode pemeriksaan:
1. one-stage assay
2. two-stage assay
3. chromogenic substrate assay
 Metode Pemeriksaan FVIII

One-stage Chromogenic
Two-stage
substrate

-Fase I
-Berdasarkan reagen (FV, CaCl₂, -Prinsip mirip fase I
kemampuan plasma fosfolipid, serum) + two-stage method.
pasien dalam plasma standar/plasma Setelah terbentuk
mengoreksi penderita (FVIII)  Fxa Fxa, Fxa diukur
perpanjangan APTT - Fase II menggunakan
dari plasma ditambahkan plasma substrat
def.FVIII substrat (FII & kromogenik
fibrinogen)  terbentuk spesifik.
bekuan
Kecepatan terbentuknya
bekuan tergantung
jumlah Fxa, Fxa
tergantung FVIII.

21
 Metode One-Stage Assay

Memerlukan plasma defisien FVIII, reagen APTT,

plasma standar, plasma normal.
 Alat yang dipakai koagulometer
Interpretasi hasil menggunakan kurva standar
dengan kertas grafik semilogaritmic atau double
logaritmic.

22
Pemeriksaan FVIII
1. Plasma kontrol dan plasma pasien dibuat
pengenceran 1:10, 1:20, 1:40 dengan lar.dapar
2. Ambil 100 µL plasma yg telah diencerkan + 100
µL plasma defisien FVIII + 100 µL reagen APTT
 inkubasi pada 37⁰C selama 5’
3. Tambahkan 100 µL CaCl₂ yang telah diinkubasi
pada 37⁰C
4. Catat lama waktu terbentuk bekuan
5. Hasil dari plasma pasien maupun kontrol diplot
pada kurva standar.

23
 24
Interpretasi pengukuran kadar FVIII²⁰
 5. Pengukuran kadar inhibitor FVIII atau
FIX
 Inhibitor FVIII diperiksa dengan mencampur
plasma pasien dengan plasma normal dengan
perbandingan yang sama + FVIII  inkubasi. Bila
plasma sampel mengandung inhibitor, FVIII akan
cepat dinetralkan.
 Satuan: BU inhibitor FVIII yang menginaktifkan
setengah dari jumlah awal kadar FVIII dalam normal
pooled plasma
 Metode yang sering dipakai:
 metode Bethesda
 modifikasi Nijmegen.
• Metode pemeriksan inhibitor FIX sama dengan inhibitor
FVIII
 Bethesda vs Nijmegen
Classical Assays
Bethesda Assay Nijmegen-Bethesda Assay

Normal Buffered
Patient Imidazole Patient FVIII
Normal
Buffer Deficient
Pooled Plasma Plasma Plasma
Plasma pH 7,4
pH 7.4
Plasm
Tes 5
a0/50 Mix Control Tes 50/50 Mix Control
t t
Mixture Incubate Mixture mixture Incubate
2hr 37o C mixture
2hr 37o C

Factor VIII activity assay

Factor VIII activity
assay

Calculate inhibitor activity (BU/ml)

Calculate inhibitor activity (NBU/ml)

Slide concept courtesy of Drs HW Verbruggen and Piet Meijer, ECAT Foundation
26
 100 2 BU = amount of
75
70 2 BU = amount
75 70 61 inhibitor that
of inhibitor
6 inactivates
that
61
1 5 75%
of FVIII in
50 0
50
4 NPP
40 0
1 BU of FVIII in NPP32 28 2
32 28
amount of
= 40
32 25 5
inhibitor 28
1 BU =
that
inactivates 25
amount
50% of of
FVIII
inhibitor
in NPP
that
inactivates
50% of
FVIII
in NPP
Grafik semilogaritmik untuk menghitung Bethesda Unit
Ringkasa
n
• Hemofilia: kelainan perdarahan kongenital yang terjadi oleh
karena adanya penurunan atau tidak adanya faktor VIII atau
faktor IX secara fungsional.
• Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan hemofilia
pada:
• Bayi laki-laki riwayat hemofilia (+) gejala (-) atau gejala (+)
• Remaja atau dewasa asimtomatik yang mengalami perdarahan
yang berlebihan pada saat trauma
• Individu asimtomatik yang mengalami pemanjangan APTT.
• Diagnosis lab penderita hemofilia:
• pemeriksaan penyaring: (clotting time (CT), PT, APTT)
• Mixing test
• Differential APTT
• Pemeriksaan FVIII, FIX,
• Pemeriksaan inhibitor FVIII dan inhibitor FIX.