LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN BAKTERI

OLEH :

MUHAMMAD ARAS AZDIRA

2006110431

AGROTEKNOLOGI-C

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS

RIAU

PEKANBARU

2021
I. JUDUL
Judul pada praktikum mikrobiologi kali ini yaitu pewarnaan bakteri

II. TUJUAN
Tujuan pada praktukum kali ini yaitu
III.ALAT DAN BAHAN
3.1 Alat
Alat yang di gunakan dalam praktikum ini adalahMikroskop, Gelas objek, Pipet, Jarum ose.
3.2 Bahan
Bahan yang di gunakan dalam praktikum ini adalah Lactobacillus caset, Eschericia
coli, Bacillus subtilis, Larutan Kristal violet, Larutan yodium Gram (Lugo), Alcohol 95%,
Larutan safranin, Larutan m alachile green.

IV. TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.

Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin
yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam
pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan
ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina.(aditya, 2010)

Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu

bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative. Pada pewarnaan Gram, hasil yang
didapat akan ditentukan dari komposisi dinding sel bakteri. Pada pewarnaan Gram ini,
reagen yang digunakan ada 4 jenis, yaitu Kristal violet, iodine, alkohol dan safranin.
Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristalviolet sehingga
ketika diamati dengan mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri
Gram
negative tidak dapat mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna
safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga akan memperlihatkan warna merah. Uji
biokimia untuk gram negative adalah uji oksidasi sedangkan untuk gram positif dapat
dilakukan pewarnaan endospora (Pratita, 2012) .
Pewarnaan gram merupakan salah satu metode untuk mengetahui morfologi
bakteri, yang bermanfaat untuk mengetahui apakah biakan bakteri masuk dalam
golongan gram positif atau gram negative. Bakteri gram negative memiliki ciri – cirri
tidak dapat menahan zat warna setelah dicuci dengan alkohol 95 % selama 5 sampai 10
detik (Samsundari, 2006)
Salah satu pewarnaan yang sering digunakan untuk mengindentifikasi bakteri
adalah perwarnaan Gram. Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibagi menjadi dua
golongan, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet.
Bakteri yang tetap berwarna ungu dengan pewarnaan oleh Kristal violet disebut bakteri
Gram positif, sedangkan bakteri yang warna ungunya hilang jika dibilas dengan
alkohol, tetapi tetap berwarna merah muda karena menahan warna merah safranin
disebut bakteri Gram negative ( James, 2008 ) .
Pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk
membedakan bakteri gram positif dan gram negative. Perbedaan warna pada bakteri gram
positif dan gram negative menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel
antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri gram positif memiliki struktur dinding sel
dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram negative memiliki
sturktur dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri, 2011).
Ditinjau dari komponen penyusun dinding sel bakteri gram positif relative lebih
sederhana berbanding bakteri gram negative yaitu terdiri dari dua sampai tiga lapis
membrane sitoplasma yang tersusun dari asa teikhik dan asam teikhouronik berupa
polimer yang larut dalam air, sedangkan dinding sel bakteri negative lebih kompleks dan
lebih tebal, tersusun dari peptidoglikon, lipoprotein dan lipopolisakarida, sehingga
dinding sel bakteri gram positif lebih permeable terhadap senyawa yang bersifat hidrofil
dibandingkan sel bakteri gram negative (Fatimah, 2006).
Sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna, maka untuk melakukan
pengamatan dibawah mikroskop diperlukan pewarnaan mikroorganisme dengan
menggunakan pewarna. mikroorganisme pada dasarnya adalah Pewarnaan prosedur
mewarnai mikroorganisme menggunakan zat warna yang dappat menonjolkan struktur
tertentu dari mikroorganisme. Sebelum dilakukan pewarnaan, mikroorganisme harus
difiksasi terlebih dahulu agar terikat pada kaca objek. Tanpa adanya fiksasi akan
mengakibatkan zat warna yang pada n MUH diberikan pada mikroorganisme tidak
melekat karena luntur setelah pencucian zat warna dengan air mengalir (Brown, 2005).
Pewarnaan yang sering digunakan dalam mengidentifikasi bakteri adalah
pewarnaan Gram. Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan
yaitu Gram negatif dan Gram positif. Prinsip pewarnaan gram tergantung dengan reaksi
dindig sel bakteri terhadap tinta safranin dan krista violet. Bakteri yang telah diuji dengan
pewarnaan berwarna ungu menunjukkan Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna
merah menunjukkan Gram negatif (Brown, 2005).
Bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup dan mengalami
tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk
melalui sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.
(pelczar,1986)
Dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat
menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan tersebut
adalah dengan penggunaan larutan Hijau Malakit 5%, dan untuk memperjelas
pengamatan, sel vegetatif juga diwarnai dengan larutan Safranin 0,5% sehingga sel
vegetatif ini berwarna merah, sedangkan spora berwarna hijau.(volk&wheeler,1988)
V. CARA KERJA
5.1 Persiapan dan Fiksasi
1) Kultur cair. Sebarkan satu loop kultur cair pada gelas obyek
sehingga mencapai diameter kira-kira 1-1,5 cm. keringkan di udara,
dan difiks engan nyala api kecil.
2) Kultur padat (koloni). Berilah setetes air pada gelas obyek, dan
ambillah sejumlah kecil pertumbuhan microbe (koloni) menggunakan
ujung loop, kemudian disebarkan pada tetesan air di atas gelas objek
sehingga mencapai diameter kira-kira 1-1,5 cm. Suspensi yang
terbentuk tidak boleh terlalu k eruh untuk mencegah terbentuknya
lapisan film yang terlalu tebal. Keringkan di udara, dan difiksasi dengan
nyala api kecil.

5.2 Pewarnaan Gram

1) Pada gelas objek yang telah difiksasi teteskan (1-2 tetes) pewarna Kristal
violet dan dibiarkan selama 30 detik.
2) Bilas dengan air kran dengan cara memegang gelas objek pada posisi miring.
3) Buanglah sisa air yang tertinggal, dan tetesi dengan larutan yodium Gram
(Lugol) sebanyak 1-2 tetes dan biarkan selama 30 detik.
4) Sel kembali dicuci dengan air, kemudian dihilangkan warnanya
menggunakan dengan pemberian alcohol 95% sebanyak 1-2 tetres dan
biarkan selama 20 detik.
5) Setelah dicuci, kemudian diwarnai dengan "counterstain" yaitu
larutan safranin selama 20 detik.
6) Bilaslah dengan air, dan keringkan dengan kertas serap/tissue (lihat
gambar 15).
7) Periksalah di bawah mokroskop menggunakan lensa objektif minyak
imersi (ditandai dengan angka 100%), dan
8) Catatlah bentuk dan wama sel serta cara pengelompokan
(tunggal, berpasangan, rantai b ergerombol dan sebagainya).

5.3 Pewarnaan Spora

1) Teteskan nialasit green di atas gelas obyek yang telah diiksasi, dar biarkan 20 menit
tanpa pemanasan, atau selama 5 menit di atas penangas air.
2) Setiap kali pewarna menjadi kering, tambahkan lagi pewarna yang baru.
3) Cucilah hati-hati dengan air selama 20-30 detik, kemudian diberi safranin selama
30 detik.
4) Setelah dibilas dengan air, kemudian dikeringkan dengan kertas serap/tissue.
5) Periksalah di bawah mikroskop menggunakan lensa obyektif minyak immerse, serta
amati bentuk dan letak spora di dalam sel (spora biasanya berwarna hijau
sedangkan sel vegetative berwarna merah jambu atau pink).
6) catat apakah sel vegetative membengkak dengan adanya spora , atau besarnya tetap.
VI. HASIL DAN PEMBAHASAN
6.1. HASIL
6.1.1 Escheria coli

Bentuk bakteri : batang

Warna bakteri : merah
Susunan bakteri : menyebar
Cat bakteri : safranin
Latar belakang transparan
Perbesaran : 1000x
6.1.2 Bachillus subtilis

Bentuk bakteri : batang

Warna bakteri : ungu
Susunan bakteri : berderet
Cat bakteri : kristal violet
Latar belakang : transparan
Perbesaran : 1000x
6.2.PEMBAHSAN
Escherichia coli merupakan bakteri komensal yang dapat bersifat patogen,
bertindak sebagai penyebab utama morbiditas dan mortalitas diseluruh dunia
(Tenailon et al., 2010)
E. coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek yang
memiliki panjang sekitar 2 µm, diameter 0,7 µm, lebar 0,4-0,7 µm dan bersifat
anaerob fakultatif. E. colimembentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus
dengan tepi yang nyata (Smith Keary, 1988; Jawetz et al., 1996).
 Pada umumnya bakteri memerlukan kelembaban yang cukup tinggi
sekitar 85% (Madigan dan Martinko, 2005).Escherichia coli merupakan
golongan bakteri mesofilik yaitu bakteri yang suhu pertumbuhan optimumnya
15-45°C dan dapat hidup pada pH 5,5-8. E. coliakan tumbuh secara optimal
pada suhu 27° C. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Hawa et al. (2011), E.
coli memiliki suhu maksimum pertumbuhan 40-45°C, di atas suhu tersebut
bakteri akan mengalami inaktivasi. Penentuan serotipe bakteri E. coli
berdasarkan antigen dinding sel (O), kapsular (K), dan flagela (H) Diperkirakan
terdapat 173 antigen O, 80 antigen kapsular (K), 56 antigen H yang telah
diisolasi (Gyles dalam Gyles dan Thoen, 1993).
B. subtilis merupakan bakteri gram positif yang dapat membentuk
endospora yang berbentuk oval di bagian sentral sel. Hasil uji pewarnaan gram
menunjukkan bahwa B. subtilis merupakan bakteri gram positif karena
menghasilkan warna ungu saat ditetesi dengan larutan KOH. Warna ungu yang
muncul pada pewarnaan gram tersebut dikarenakan dinding sel B. subtilis
mampu mempertahankan zat warna kristal violet (Aini et al. 2013). Sel Bacillus
spp. berbentuk batang, berukuran 0,3-2,2 x 1,2-7,0 μm dan mempunyai flagel
peritrikus, memproduksi spora bentuk silinder yang tidak membengkak,
bersifat aerob atau anaerob fakultatif serta heterotrof, katalase positif, sel gerak
yang membentuk endospora elips lebih tahan daripada sel vegetatif terhadap
panas, kering dan faktor lingkungan lain yang merusak. Permukaan sel bakteri
ditumbuhi merata flagellum pristikus. B. subtilis merupakan kelompok fisiologi
yang berbeda dari bakteri non-patogen, yang relatif mudah dimanipulasi secara
genetika dan sederhana dibiakkan, yang memperkuat kesesuaiannya untuk
kepentingan industri(Soesanto 2008).
Bacillus pertama kali dideskripsikan oleh Cohn pada tahun 1872 pada
B. subtilisyang semula disebut Vibrio subtilis oleh Ehrenberg pada 1835
(Gordon 1981 dalamHatmanti 2000).
VII. PENUTUP
7.1 Kesimpulan
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna
untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk
dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin.
Pewarnaan gram merupakan salah satu metode untuk mengetahui
morfologi bakteri, yang bermanfaat untuk mengetahui apakah biakan bakteri masuk
dalam golongan gram positif atau gram negative. Bakteri gram negative memiliki
ciri – cirri tidak dapat menahan zat warna setelah dicuci dengan alkohol 95 %
selama 5 sampai 10 detik.
E. coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek
yang memiliki panjang sekitar 2 µm, diameter 0,7 µm, lebar 0,4-0,7 µm dan
bersifat anaerob fakultatif. E. colimembentuk koloni yang bundar, cembung,
dan halus dengan tepi yang nyata.
B. subtilis merupakan bakteri gram positif yang dapat membentuk
endospora yang berbentuk oval di bagian sentral sel. Hasil uji pewarnaan gram
menunjukkan bahwa B. subtilis merupakan bakteri gram positif karena
menghasilkan warna ungu saat ditetesi dengan larutan KOH. Warna ungu yang
muncul pada pewarnaan gram tersebut dikarenakan dinding sel B. subtilis mampu
mempertahankan zat warna kristal violet.
7.2 Saran
Menurut saya sebaiknya sebelum melakukan praktikum, praktikan
memahami materi yang akan di pelajari agar mempermudah jalannya praktikum,
serta dalam menjalankan praktikum harus telili dan mengikuti cara kerjanya dengan
baik agar mendapatkan hasil sesuai dengan yang diinginkan. Sebaiknya praktikum
ini dilakukan secara luring agar terjadi interaksi yang baik dan lebih mudah dalam
pemahamannya.
 DAFTAR PUSTAKA

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri.

Aini, F.N., S. Sukamto, D. Wahyuni, R.G Suhesti, dan Q. Ayyunin. 2013. Penghambatan
pertumbuhan Colletotrichum gloeosporioides oleh Trichoderma harzianum,
Trichoderma koningii, Bacillus subtilis dan Pseudomonas fluorescens. Jurnal Pelita
Perkebunan 29(1): 44-52.

Fatimah, Cut, Urip H., Isma S., Safrida, Ernawati, 2006, Uji Aktivits Antibakteri Ekstrak Daun
Angsana Secara In Vitro, Jurnal Ilmiah PANNMED, Vol. 1 , No. 1.

Fitri, L., Yekki Y., 2011, Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Kitinolitik, Jurnal
Ilmiah Pendidikan Biologi, Vol. 3 , No. 2.

Gyles, C.L. 1993. Escherichia coli. Dalam Pathogenesis of Bacterial Infection in Animal.Gyles,
C.L., Thoen, C.O. (eds). 2 Ed. Iowa State University Press. Ames, USA.: 164-187.

Hatmanti, A. 2000. Pengenalan Bacillus Spp. Oseana, 25(1): 31-41.

James, Joyce, Colin B., Helen S., 2008, Prinsip – Prinsip Sains Untuk Keperawatan, Erlangga
Medical Sains, Jakarta.

Jawetz, Ernest. 1996. Mikrobiologi Kedokteran edisi 20. Jakarta: EGC.

PELCZAR, Michael J (1986) Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid I. Jakarta: UI PRESS .

Pratita, Maria Yuli E., Surya Rosa P., 2012 , Isolasi dan Identifikasi Bakteri Termofilik Dari
Sumber Mata Air Panas Di Songgoriti Setelah Dua Hari Inkubasi, Jurnal Teknik
Pomits, Vol. 1, No. 1.

Samsundari, Sri, 2006, Pengujian Ekstrak Temulawak dan Kunyit Terhadap Resistensi Bakteri
Aeromonas hydrophilla Yang Menyerang Ikan Mas, Gamma, Vol. 11, No. 1 .

Soesanto, L. 2008. Pengantar Pengendalian Hayati Penyakit Tanaman, Suplemen ke Gulma

dan Nematoda. Rajawali Pers. 573 p.

Smith-Keary P. F. 1988. Genetic Elements in Escherichia coli. London: Macmillan Molecular

biology series.

Tenailon O, Skurnik D, Picard B, Denamur E. 2010. The Population Genetics of Commensal

Escherichia coli. Us National Library of Medicine, National Institutes of Health.

Volk, Wesley A, Wheeler, Margaret F.1988. Mikrobiologi dasar jilid 1. Erlangga, Jakarta.
Yang, C., & Brown, B. B. (2015). Computers in Human Behavior Factors Involved In
Associations Between Facebook Use and College Adjustment : Social Competence ,
Perceived Usefulness , and Use patterns. COMPUTERS IN HUMAN BEHAVIOR, 46,
245– 253. https://doi.org/10.1016/j.chb.2015.01.015