LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN BAKTERI




D
I
S
U
S
U
N
OLEH:

NAMA : DINY ASYIFAH
NIM : 08111006048
KELOMPOK : VB




LABORATORIUM BIOLOGI FARMASI
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
INDRALAYA
2013
PRAKTIKUM III
PEWARNAAN BAKTERI

I. Tujuan Praktikum
Memahami dan mengetahui macam-macam pewarnaan dan
melakukan pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan gram negatif
dan preparat tetesan bergantung.

II. Prinsip Percobaan
Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna
dan dengan ion protoplasma sel.

III. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling
banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu
jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri
mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan
pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel
bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana
ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan
sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna
dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna
yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air
furksin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk
mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam
gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan
morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin
atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram
negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding
sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan
zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram
positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat
warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini
akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan
struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar
yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol,
sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah.
Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan
yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding
sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel
tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu
dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak
ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-
4%)
Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap
penisilin
Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan oleh
pewarna basa (VK)
Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif
kompleks
Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh
Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna
tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan
penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan
permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung
pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri
menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh
zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%).
Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan
dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram.
Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan
tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam.
Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan
biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada
seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar
asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian
dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci
dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3%
(hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit
kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan
dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh
permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir
(Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur
khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh
pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium,
Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora
dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif,
sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan
fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan
dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel
vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di
bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan
transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana,
endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)

a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan
tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul,
karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga
memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias
menembusnya dengan cara memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang
tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk
DNA (Rudi, 2010).

IV. Alat dan Bahan
Alat:
Jarum ose
Kaca objek
Mikroskop
Tusuk gigi

Bahan:
Kultur bakteri
NaCl faali
Larutan biru metilen
Kristal violet
Larutan lugol
Etanol
Tinta cina
Kotoran gigi


V. Prosedur kerja
1. Pembuatan preparat ulas
Pada medium cair
Inokulum bakteri yang telah dikembangkan > dimasukkan ke
tabung reaksi > beri larutan NaCl > tetesi pada kaca objek >
keringkan preparat.
Pada medium Padat
Biakan bakteri diletakkan diatas kaca objek > teteskan 2 tetes NaCl
> keringkan preparat

2. Pewarnaan sederhana
Preparat ulas > beri larutan metilen blue > biarkan 30 detik > cuci
dan keringkan di atas kertas saring > amati dibawah mikroskop
100x.

3. Pewarnaci dengan gram
Preparat ulas > fiksasi > beri larutan kristal violet 1 menit > cuci
dengan air > beri larutan lugol > Cuci dengan alkohol > keringkan
> amati dbawah mikroskop.

4. Pewarnaan negatif
2 kaca objek > satu kaca objek ditetesi tinta cina > ambil kotoran gigi
dgn tusuk gigi > campur dgn tinta di atas objek > gesekan kaca objek
pada campuran > biarkan preparat mengering di udara > amati dibawah
mikroskop.







VI. Data Hasil Pengamatan


E. coli S. thypii
Kotoran
gigi
P. sederhana p. gram p. sederhana p. gram p. negatif
Medium
Cair
(-) (-) (+) (-)
Medium
Padat
(-) (-) (-) (-)
Kotoran
gigi
(+)





















VII. Pembahasan
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah
satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion
bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk
membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan
yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat
warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen
blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada
umumnya adalah Cl
-
, SO
4 -
, CH
3
COO
-
, COOHCOO. Zat warna asam
umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian
sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-
bagian inti sel (Rudi, 2010).
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi,
peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat
warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu
dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam praktikum ini digunakan
salah satu pewarnanya yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa
sehingga lebih mudah bersenyawa atau bereaksi dengan bagian-bagian inti
sel bakteri.
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan
zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau
merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi,
2010).

1. Escherichia coli


Gambar E. coli dengan perbesaran 1000 x
Klasifikasi ilmiah
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : E. coli
Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli pada
air WC. Berbentuk E. coli adalah basil (batang) yang pendek. Bakteri
tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah muda yang
berarti bahwa bakteri ini bersifat gram negatif.
Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang
termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E.
coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu
sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan
tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang
menyebabkan penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik
uremic (hus), infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis.
Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah
di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada
feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E.
coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa
digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang
diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki pertumbuhan
yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Fajriana, 2008).


2. S. thypii
Berdasarkan pewarnaan gram bakteri, Salmonella typhi adalag
bakteri gram negatif. bisa berada dalam air, es, debu, sampah kering
yang bila organisme ini masuk ke dalam vehicle yang cocok (daging,
kerang dan sebagainya) akan berkembang biak mencapai dosis infekti.
Dimensi Bakteri berbentuk batang, tidak berspora dan tidak
bersimpai tetapi mempunyai flagel feritrik (fimbrae), pada pewarnaan
gram bersifat gram negatif, ukuran 2- 4 mikrometer x 0.5-0.8
mikrometer dan bergerak.
Adapun bakteri salmonella dapat diklasifikasikan sebagai berikut :
Kelas :Psilopsida.
Ordo :Psilotales.
Family :Psilotaceae.
Genus :Salmonella.
Species :salmonella typhi.









VIII. Kesimpulan
1. Pada pewarnaan gram bakteri ini pewarnaan menggunakan metode
pewarnan sederhana yang menggunakan larutan metilen blue sebagai
pewarna utama, pewarnaan gram yang menggunakan larutan kristal
violet sebagai pewarna uutama dan dicuci dengan alkohol, serta
pewarnaan negatif menggunakan kotoran gigi dengan menggunakan
tinta cina.
2. E.coli dan S.thypii merupakan bakteri gram negatif karena saat dibilas
dengan air maupun alkohol pewarnaan menjadi hilang, itu artinya
bakteri e.coli dan s.thypii memiliki komposisi dinding sel yang
sebagian besar tersusun dari lapisan lipid, sehingga pada saat
pewarnaan kurang mempertahankan zat warna.
3. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan
Gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal
atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak
sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini
berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif. Langkah-langkah
utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain:
a. Pembuatan olesan bakteri
b. Fiksasi
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.










Daftar Pustaka

Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http //pewarnaan
bakteri\MikroumPewarnaan Gram RIZQI FAJRIANA BLOGS.htm/.
11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Hardiningsih, Riani, Rostiati Nonta Refina Napitupulu, dan Titin Yulinery. 2006.
Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah.
Biodiversitas Vol 7 No. 1.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I.
Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok,
Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam
untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri.
http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-
bakteri.html. 11 November 2010.