I.

JUDUL
Pewarnaan Sederhana pada Bakteri

II.

TUJUAN
1. Agar mahasiswa dapat mengetahui morfologi dan struktur sel
mikroorganisme dengan mewarnai sel.

III.

DASAR TEORI
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling
banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan
satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana
karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan
rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol
fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua
jenis pewarnaan, yaitu :
a. Pewarnaan Asam atau Positif
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat
warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat
warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru
dan air furksin. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu
padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh
kesulitan serta mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi
bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri
pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
b. Pewarnaan Basa atau Negatif

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan

untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi
hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan

(tembus

pandang).

Teknik

ini

berguna

untuk

menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan

cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938)
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan

antara

pneumokokus

dan

bakteri

Klebsiella

pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak

mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan
Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram
negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri

gram

negative

mempertahankan zat

adalah

warna metil

bakteri

yang

tidak

ungu pada metode

pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan

warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan
zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri
jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar
yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga
pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram
positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.
Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit
akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan
warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak
merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram
negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria,
2009).
Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup
yang

tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri memiliki

beragam variasi bentuk, seperti coccus, basil, dan spiral, serta dapat
hidup soliter maupun berkoloni. Habitat bakteri sangat bervariasi, dari
air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan, (Betsy dan Keogh. 2005).
Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga

tidak

berwarna

dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium

dimana

mereka

hidup.

Oleh

karena

itu,

perlu

dilakukan

pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop

(Harley dan Presscot, 2002). Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu
basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun

kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya

yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus
dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus.
Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan
melengkung (Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil.
Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama
dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).Teknik
Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku
(Lay.1994). Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu
untuk

mengetahui

teknik

pewarnaan

mikroorganisme

mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

IV.

ALAT dan BAHAN

Alat :
1. Mikroskop
2. Objeck glass
3. Jarum Ose
4. Korek
5. Lampu spiritus
6. Tisu
7. Kapas
8. Sabun Cuci

Bahan :
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bakteri Bacillus
Bakteri Tetracoccus
Bakteri Providencia
Bakteri Staphylococcus
Bakteri
Akuades

sehingga

7. Minyak Imersi
8. Pewarna Methylen blue (biru)
9. Pewarna Kristal violet (ungu)
10. Pewarna Safranin (merah)
11. Tinta Nigrosin / Tinta Cina (hitam)
12. Xylol
V.

CARA KERJA
Skema Pewarnaan Positif :
1. Bersihkan object glass dengan kapas
2. Tuliskan nama bakteri pada sudut object glass
3. Panaskan jarum ose mulai dari ujung sampai pangkal jarum,lalu
ambil akuades di dalam tabung reaksi dengan menggunakan jarum
ose sebanyak 2-3 tetes,lalu panaskan kembali jarum ose supaya
jarum ose tetap steril.
4. Pindahkan biakan bakteri pada tempatnya menggunakan jarum ose
satu ulasan saja dan disebarkan di object glass yang sudah ada
akuadesnya supaya sel bakteri merata,jangan lupa setelah dipakai,
jarum ose dipanaskan lagi diatas api mulai dari ujung sampai
pangkal jarum.
5. Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen
(lewatkan di atas api sampai kering).
6. Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan
pewarna Methylen Blue,Safranin,Crystal Violet) dan tunggu kurang
lebih 30 detik.
7. Cuci dengan air mengalir dengan perlahan, kemudian keringkan
dengan kertas tissue (pada saat mengeringkan jangan sampai bakteri
yang ada di tegah object glass ikut hilang dengan kertas tissue).
8. Keringkan kembali ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api
bunsen (lewatkan disamping api sampai kering).
9. Periksa dengan mikroskop (sampai perbesaran 100 x 10) pada
perbesaran 40x ke 100x ,jangan lupa ditetesi minyak imersi 1-2 tetes
dari sisi lensa.
10. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif
100x dengan kapas yang sudah di sediakan dan dibasahi xylol.
Cara Pewarnaan Negatif :
1. Bersihkan object glass dengan kapas

2. Tuliskan nama bakteri pada sudut object glass

3. Teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object
glass. Panaskan jarum ose mulai dari ujung sampai pangkal jarum,
lalu ambil biakan dengan jarum ose dan ulaskan dalam tetesan
nigrosin yang berada pada objeckc glass, jangan lupa setelah dipakai,
jarum ose dipanaskan lagi diatas api mulai dari ujung sampai
pangkal jarum.
4. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan kesamping
kiri
5. Keringkan ulasan tersebut di udara, jangan memfiksasinya dengan
api bunsen (lewatkan disamping api sampai kering).
6. Setelah benar-benar kering dan tersebar, periksa dengan mikroskop
(sampai perbesaran 100 x 10) pada perbesaran 40x ke 100x ,jangan
lupa ditetesi minyak imersi 1-2 tetes dari sisi lensa.
7. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif
100x dengan kapas yang sudah di sediakan dan dibasahi xylol.
VI.

HASIL

VII.

PEMBAHASAN
Pada percobaan pertama yaitu pewarnaan basa menggunakan
metiline blue. Setelah dimati di bawah mikroskop, dapat diketahui
bahwa sel bakteri Tetracoccus, Bacillus sp, Providencia.