LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI & IDENTIFIKASI BAKTERI

“Pseudomonas sp”
20-22 Juni 2019

Disusun Oleh :
Millenia Ramadhani
411117016

STIKES JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI

Jl. Terusan Jend. Sudirman, Baros, Cimahi Tengah, Kota
Cimahi, Jawa Barat 40531
A. Tujuan Praktikum
Untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Pseudomonas dari sampel x.

B. Prinsip
 Fermentasi Karbohidrat
Perubahan warna dari ungu menjadi kuning menandakan bakteri
menghasilkan asam , serta adanya gelembung udara menandakan
bakteri menghasilkan gas.
 Reaksi Indol
Dengan penambahan reagen Kovaks (Paradimetil amino benzal dehid),
Tryptophan akan dirubah menjadi indol, asam piruvat dan ammonia oleh
Tryptophanase.
 Reaksi MR
Glukosa + H2O ―› Asam laktat ―› CO2+ H2
Asam asetat
Asam format
 Reaksi VP
Acetylmetil karbinol ditambahkan Alpha naftol akan mengalami oksidasi
yang dibantu oleh KOH 40% menjadi diasetil dan guanidine.
 Reaksi Citrat
CO2 + 2Na+ +H2O ―› Na2CO3 ―› Alkaline pH―› Perubahan warna dari
hijau ke biru.
 TSIA
a) Pembentukan H2S dari cystein asam amino dimana pepton
terdapat dalam media.
b) Pembentukan H2S dari reaksi anorganik bahan yang mengandung
sulfur yaitu Na2S2O3.
C. Dasar Teori
1. Klasifikasi Ilmiah
Kerajaan : Bacteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Pseudomonadales
Famili : Pseudomonadaceae
Genus : Pseudomonas
Spesies : Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri gram negatif aerob

obligat, berkapsul, mempunyai flagella polar sehingga bakteri ini bersifat
motil, berukuran sekitar 0,5-1,0 µm. Pseudomonas aeruginosa tidak
menghasilkan spora dan tidak dapat menfermentasikan karbohidrat.
Pada uji biokimia, bakteri ini menghasilkan hasil negatif pada uji Merah
Metil, danVoges-Proskauer. Bakteri ini secara luas dapat ditemukan di
alam, contohnya di tanah, air, tanaman, dan hewan. Psedomonas
aeruginosa adalah patogen oportunistik. Bakteri ini merupakan penyebab
utama infeksi pneumoni anosokomial. Meskipun begitu, bakteri ini dapat
berkolonisasi pada manusia normal tanpa menyebabkan penyakit.
Ketika bakteri ini ditumbuhkan pada media yang sesuai, bakteri ini
akan menghasilkan pigmen non fluoresen berwarna kebiruan, piosianin.
Beberapa strain Pseudomonas juga mampu menghasilkan pigmen
fluoresen berwarna hijau, yaitu pioverdin. Pseudomonas aeruginosa
memproduksi katalase, oksidase, dan amonia dari arginin. Bakteri ini
dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya.
2. Morfologi
Pseudomonas aeruginosa berbentuk batang dengan ukuran sekitar
0,6 x 2 μm. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan
terkadang membentuk rantai yang pendek. Pseudomonas aeruginosa
termasuk bakteri gram negatif. Bakteri ini bersifat aerob, katalase positif,
oksidase positif, tidak mampu memfermentasi tetapi dapat mengoksidasi
glukosa / karbohidrat lain, tidak berspora, tidak mempunyai selubung
(sheat) dan mempunyai flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub)
sehingga selalu bergerak. Bakteri ini dapat tumbuh di air suling dan akan
tumbuh dengan baik dengan adanya unsur N dan C. Suhu optimum
untuk pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa adalah 42oC.
Pseudomonas aeruginosa mudah tumbuh pada berbagai media
pembiakan karena kebutuhan nutrisinya sangat sederhana. Di
laboratorium, medium paling sederhana untuk pertumbuhannya
digunakan asetat (untuk karbon) dan ammonium sulfat (untuk nitrogen).
Pembiakan dari spesimen klinik biasanya menghasilkan satu atau dua
 tipe koloni yang halus yaitu : 1) Koloni besar dan halus dengan
permukaan rata dan meninggi, 2) Koloni halus dan mukoid sebagai hasil
produksi berbahan dari alignat. Tipe ini sering didapat dari sekresi
saluran pernafasan dan saluran kemih.
Pseudomonas aeruginosa membentuk biofilm untuk membantu
kelangsungan hidupnya saat membentuk koloni pada paru-paru manusia.
Terkadang menghasilkan bau yang manis dan menyerupai anggur.
Koloni yang dibentuk halus bulat dengan warna fluoresensi yang kehijau-
hijauan. Bakteri ini menghasilkan pigmen yang tak berfluoresensi
kehijauan (plosianin). Strain Pseudomonas aeruginosa menghasilkan
pigmen yang berfluoresensi antara lain : piooverdin (warna hijau),
piorubin (warna merah gelap), piomelanin (hitam). Pseudomonas
aeruginosa yang berasal dari koloni yang berbeda mempunyai aktivitas
biokimia, enzimatik dan kepekaan anti mikroba yang berbeda pula.

3. Waktu Generasi
Waktu generasi adalah waktu yang diperlukan oleh mikroorganisme
untuk meningkatkan jumlah sel menjadi dua kali lipat jumlah semula.
Kurva pertumbuhan mikroorganisme terdiri atas empat fase yaitu fase
penyesuaian ( lag phase ), fase eksponensial atau fase logaritmik, fase
stasioner dan fase kematian. Pada fase eksponensial terjadi peningkatan
jumlah sel dan digunakan untuk untuk menentukan waktu generasi.
Beberapa contoh waktu generasi pada suhu pertumbuhan yang optimal
antara lain 30 menit untuk Bacillus cereus , 20 menit untuk Escherichia
coli dan Salmonella , dan 10 menit untuk Clostridium perfringens.

4. Epidemiologi dan Patogenesis

 Epidemiologi
Pseudomonas aeruginosa pertama kali diisolasi dari nanah
hijau dengan Gessard tahun 1882. Hal ini kemudian terbukti
terlibat dalam berbagai infeksi manusia dari sepsis neonatal dan
 membakar sepsis terhadap infeksi paru-paruakut dan kronis.
Pseudomonas aeruginosa dibedakan sebagai patogen
oportunistik, menyebabkan infeksi pada pasien dengan cacat fisik,
fagositosis, atau kekebalan pada mekanisme pertahanan tuan
rumah. Membuktikan berbagai ekologis dan kemampuan bertahan
hidup yang luas, Pseudomonas aeruginosa juga merupakan
patogen tanaman penting, mempengaruhi tembakau, tomat dan
selada, bisa ditemukan di lingkungan air yang paling segar,
termasuk daerah lembab di rumah sakit.
Pseudomonas aeruginosa menyebabkan kontaminasi pada
perlengkapan anestesidan terapi pernafasan, cairan intravena,
bahkan air hasil proses penyulingan. Endoskopi, termasuk
bronkoskopi adalah alat-alat medik yang paling sering
dihubungkan dengan berjangkitnya infeksi nosokomial. Suatu
penelitian di AS membuktikan bahwa dari 414 pasien yang
menjalani prosedur bronkoskopi didapati 9.4% infeksi saluran
nafas atas dan bawah serta infeksi lewat aliran darah, dan pada
66.7% dari infeksi tersebut didapati Pseudomonas aeruginosa
sesudah dilakukan kultur. Karena merupakan patogen
nosokomial, maka metode untuk mengendalikan infeksi ini mirip
dengan metode untuk patogen nosokomial lainnya.
Kemampuannya untuk tumbuh subur dalam lingkungan yang
basah menuntut perhatian khusus pada bak cuci, bak air,
pancuran, bak air panas, dan daerah basah yang lain.
 Patogenesis
Kemampuan Pseudomonas aeruginosa mennyerang jaringan
bergantung pada produksi enzim-enzim dan toksin-toksin yang
merusak barier tubuh dan sel-sel inang. Endotoksin
Pseudomonas aeruginosa seperti yang dihasilkan bakteri gram
negative lainnya, menyebabkan gejala sepsis dan syokseptic.
Bakteri yang baru diisolasi dari paru-paru penderita fibrosis kistik
 bersifat mukoid. Lapisan alginat yang mengelilingi bakteri dan
mikrokoloni bakteri dalam paru-paru berfungsi sebagai adhesion
dan kemungkinan mencegah fagositosis bakteri, bahkan dapat
meningkatkan resistensi Pseudomonas aeruginosa terhadap
antibiotika.
Strain Pseudomonas aeruginosa yang mempunyai sistem
sekresi tipe III yaitu sekresi tipe III adalah sistem yang dijumpai
pada bakteri gram negative, teridir dari 30 rotein yang terbentang
dari bagian dalam hingga luar membrane sel bakteri, berfungsi
seperti jarum suntik yang menginjeksi toksin-toksin secara
langsung ke dalam sel inang sehingga memungkinkan toksin
mencegah netralisasi antibody. Pseudomonas aeruginosa
bersifat pathogen hanya bila memasuki daerah dengan sistem
pertahanan yang tidak normal, misalnya saat membrane mukosa
dan kulit robek karena kerusakan jaringan langsung, sewaktu
penggunaan kateter intravena atau kateter air kemih, atau bila
terdapat nuetropenia, seperti pada kemoterapi kanker.

5. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan

 Faktor Intrinsik
Faktor intrinsik meliputi pH, aktivitas air ( activity of water )
kemampuan mengoksidasi-reduksi ( redoxpotential ), kandungan
nutrien, bahan antimikroba dan struktur bahan makanan. Ukuran
keasaman atau pH adalah log 10 konsentrasi ion hidrogen.
Lazimnya bakteri tumbuh pada pH sekitar netral (6,5 – 7,5)
sedangkan kapang dan ragi pada pH 4,0-6,5.
Mikroorganisme dibagi menjadi aerob, anaerob, fakultatif
anaerob dan mikroaerofilik. Pertumbuhan mikroorganisme
memerlukan air, energi, nitrogen, vitamin dan faktor pertumbuhan,
mineral. Air yang tersedia untuk pertumbuhan mikroorganisme
ditentukan oleh aw bahan makanan. Sebagai sumber energi,
 mikroorganisme memanfaatkan karbohidrat, alkohol dan asam
amino yang terdapat dalam bahan makanan.
Faktor pertumbuhan yang diperlukan adalah asam amino,
purin dan pirimidin, serta vitamin. Salmonella typhi memerlukan
triptofan untuk pertumbuhannya, sedangkan Staphylococcus
aureus memerlukan arginin, sistein dan fenil alanin.
 Faktor Entrinsik
Faktor ekstrinsik yang mempengaruhi pertumbuhan
mikroorganisme adalah suhu penyimpanan dan faktor luar lainnya
yang pada prinsipnya berhubungan dengan pengaruh atmosferik
seperti kelembaban, tekanan gas / keberadaan gas, juga cahaya
dan pengaruh sinar ultra violet.
Berdasarkan suhu optimumnya, mikroorganisme dibagi
menjadi psikrofil dengan suhu optimum kurang dari + 20 °C,
mesofil (+20° s/d + 40 °C) dan termofil (lebih dari +40 °C). Pada
suhu minimum terjadi perubahan membransel sehingga tidak
terjadi transpor zat hara. Sebaliknya pada suhu maksimum terjadi
denaturasi enzim, kerusakan protein dan lipida pada membran sel
yang menyebabkan lisisnya mikroorganisme. Mikroorganisme
patogen biasanya termasuk ke dalam kelompok mesofil.
Pengaruh suhu rendah pada mesofil adalah inaktivasi dan
perubahan struktur protein permease.

D. Alat dan Bahan

1. Alat yang digunakan
No. Nama alat Spesifikasi Jumlah

1. Cawan petri Ø15 cm 1 buah

2. Inkubator Mikrobiologi mement 2 buah

3. Ose bulat Kawat NICr 1 buah

4. Tabung reaksi kecil Single strange 5 buah

5. Tabung reaksi besar Double strange 3 buah

6. Tabung durham Kecil 4 buah

7. Rak tabung Φ 1 cm, 12 tabung 1 buah

8. Bunsen Volume 200 ml 1 buah

2. Bahan yang digunkana

No. Nama bahan Spesifikasi Jumlah

1. Media selektif & Mac konkey agar, AD, 1 buah

differensial NA

2. Media pengaya Tsia, simon citrat, 3 tabung

urease

3. Gula gula Glukosa, 4 tabung

laktosa,sukrosa,
mannitol

4. Sampel Biakan pseudomonas

5. Pewarnaan gram Kristalviolet,lugol, 4 botol

alkohol 96%, safranin

E. Prosedur Kerja
1. Hari ke 1 : siapkan media MCA, NA, AD. kemudian tanam sampel berupa
biakan murni pseudomonas sp dengan streak isolasi kemudian di
inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
 2. Hari ke 2 : ambil satu koloni lakukan pewarnaan gram, ambil satu koloni
dan tanam pada media gula gula ; laktosa, sukrosa, glukosa, mannitol.
Kemudian tanam pada media :
 SC (simon citrat ): ambil satu ose koloni yang sama kemudian
tanam dengan cara streak dari ujung tabung ke arah tepi.
 UREASE : ambil satu ose koloni yang sama kemudian tanam
dengan cara streak dari ujung tabung ke arah tepi.
 TSIA : ambil satu ose koloni yang sama kemudian tanam dengan
cara streak dari ujung tabung ke arah tepi setelah itu tusuk hingga
dasar tabung.
 SIM (sulfur indol motility) : ambil satu ose koloni yang sama
kemudian tanam dengan cara tusuk hingga dasar tabung.
 MR & VP : ambil satu ose koloni yang sama kemudian masukkan
kedalam media.
Semua media yang telah di tanam kemudian di inkubasi pada
suhu 37°C selama 24 jam.
3. Hari ke 3 : amati adanya pertumbuhan, pada media SIM di teteskan 3-4
tetes reagen covaks, pada media MR di teteskan methyl red sebanyak 2-
4 tetes sedangkan pada media VP di teteskan alfa naftol dan KOH 40 %
sebanyak 2-4 tetes.amati adanya perubahan warna.

F. Hasil Pengamatan
1. Pada media MC, AD, dan NA
NO CIRI KOLONI AD MCA NA
1. Bentuk Bulat Bulat Bulat
2. Diameter 1-2 mm 0,5-1 mm 1-2 mm
3. Warna Abu Putih/ Putih/
kehijauan kuning kuning
pucat pucat
4. Elevasi conveks Conveks Coveks
5. Pinggiran Rata Rata Rata
6. Konsistensi Basah basah Basah

2. Hasil pewarnaan Gram Dan hasil pada media AN

Bentuk : Basil
Susunan : Monobasil dan Streptobasil pendek
Sifat : Gram Negatif (-)
Warna : Merah
Pembesaran : 100x

3. Hasil Uji Biokimia

No Nama Hasil Uji biokimia
media Pengamatan Pseudomonas
Sampel aeruginosa

1. Gula-gula :
 Glukosa Non-Fermenter/ Fermenter/
Gas - Gas -
 Laktosa Non-Fermenter/ Non-Fermenter/
Gas - Gas -
 Sukrosa Non-Fermenter Non-Fermenter/
Gas - Gas -
 Manitol Non-Fermenter/ Non-Fermenter/
Gas - Gas -
 2. SIM :
 Sulfur - -
 Indol - -
 Motility Motil + Motil +
3. MR - -
4. VP - -
5. Simon Citrat + +
6. Urease - -
7. TSIA :
 L/D M/K(B/A) M/K(B/A)
 Gas - -
 Sulfur - -
8. Uji Oksidae + +

G. Pembahasan
Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum identifikasi bakteri
Gram (-) pada sampel biakan murni, didapatkan hasil positif adanya
pertumbuhan koloni pada media Mac Concey Agar dengan ciri khas koloni
berwarna putih/kuning pucat yang menandakan koloni bakteri dalam sampel
tidak memfermentasikan laktosa dan termasuk golongan bakteri gram
negative (-). Sedangkan pada media AD terdapat pertumbuhan koloni bakteri
berwarna abu kehijauan serta tidak melisiskan sel eritrosit (Anhemolisis).
Pada hasil pewarnaan Gram didapatkan bakteri berbentuk basil berwarna
merah karena mengikat zat warna dari safranin, yang menandakan bakteri
dalam sampel tersebut adalah bakteri Gram Negatif (-) sedangkan hasil
subkultur pada media AN didapatkan koloni bakteri berwarna putih/ kuning
pucat .
Kemudian pada hari ketiga dilakukan pengamatan pada hasil
penanaman uji biokimia dan didapatkan hasil, pada uji gula-gula semua non
fermenter yang ditandai dengan tidak adanya perubahan warna media dari
 ungu menjadi kuning yang menandakan bahwa bakteri tersebut tidak
memfermentasi seluruh karbohidrat menjadi asam dan pada tabung durham
tidak terdapat gelembung yang menandakan bahwa bakteri pada sampel
tidak menghasilkan gas. Pada uji biokimia SIM didapatkan hasil, (-) positif
pada indol yang menandakan bahwa bakteri dalam sampel tidak memiliki
enzim trypthopan. Pada sulfur menghasilkan (-) negatif yang menandakan
bahwa bakteri dalam sampel tidak menghasilkan sulfur danpada motility
menghasilkan (+) positif yang menandakan bahwa bakteri tersebut memiliki
alat gerak. Pada uji MR dihasikan (-) Negatif yang ditandai dengan tidak ada
perubahan warna menjadi merah yang menandakan bahwa bakteri dalam
sampel tidak dapat mempermentasi glukosa. Pada uji VP dihasilkan (-)
negatif karena tidak terbentuk cincin dari merah kecoklatan hingga ungu.
Pada uji TSIA dihasilkan basa/asam, gas (-) Negatif dan sulfur (-) negatif
yang ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi merah pada lereng
namun tidak adanya gas pada sisi tabung. Pada uji urease menghasilkan (-)
Negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan wana yang menandakan
bahwa bakteri dalam sampel tidak memiliki enzim urease. Pada uji simon
citrate menghasilkan (+) positif karena terjadi perubahan warna,menjadi biru,
yang menandakan bahwa bakteri dalam sampel dapat menggunakan citrate
sebagai sumber carbonya, dan pada uji Oksidase menghasilkan (+) Positif.
Dari pembahasan tersebut didapatkan derajat kemiripan sebagai berikut:
15
× 100% = 93,75%
16

H. Kesimpulan
Berdasarkan isolasi dan identifikasi , karakteristik koloni maupun hasil
uji biokimia bakteri dari sampel biakan murni berdasarkan derajat kemiripan
lebih mengarah ke bakteri Pseudomonas aeruginosa dengan derajat
kemiripan 93,57%.
 Daftar Pustaka

 Steffan, Y. George. Screening of Pseudomonas sp. Belgia (2005). pp:

246-302
 Evita Mayasari. 2005, Pseudomonas aeruginosa Karakteristik, Infeksi
dan Penanganan (Tesis), Universitas Sumatera Utara.
 Jawets, Melnick, dan Adelberg. 2005, Mikrobiologi Kedokteran, Edisi
23, alih Bahasa Huriwati Hartanto dkk, Penerbit Buku Kedokteran ECG,
Jakarta.
 Lay, Bibiana W, dan Hastowo, Sugyo. 1992, Mikrobiologi , Rajawali
Press , Jakarta
 LAMPIRAN

AD MCA NA

MR TSIA VP SC

GULA GULA UREASE SIM