LAPORANPRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LANJUT

PEWARNAAN SECARA GRAM

UNTUK MEMENUHI TUGAS MATA KULIAH

Mikrobiologi Lanjut
Dibina oleh Prof. Dra.Utami Sri Hastuti M.Pd

Oleh :
Off/Kelas: A/B
Kelompok 4

1. Ghaziah Kusumawati (180341863040)

2. Ilda Sartifa Sari (180341863067)
3. Irani Lailatul Badria (180341663067)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

PASCASARJANA
PROGAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
SEPTEMBER 2018
TOPIK : Pewarnaan Bakteri secara gram
A. TUJUAN :
 Mahasiswa dapat:
1. Memperoeh keterampilan pewarnaan bakteri secara gram
2. Dapat menentukan sifat gram dari bakteri yang diperiksa

PELAKSANAAN :
1. Pewarnaan bakteri secara gram dilakukan di Laboratorium Mikrobiolgi
O5.305, 15 September 2018.

B. DASAR TEORI :
Pewarnaan Gram
Metode pewarnaan Gram yaitu pemberian larutan Kristal violet, safranin,
iodine, alkohol, dan aquades. Pemberian larutan Kristal violet untuk memberikan
warna ungu pada mikroba sebagai pewarna primer. Pemberian larutan safranin untuk
memberikan warna merah pada mikroba sebagai pewarna sekunder. Pemberian
larutan iodine untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Pemberian larutan
alkohol untuk membilas larutan zat pewarna primer. Pemberian larutan aquades untuk
membilas kristal violet,iodin dan safranin (Waluyo, 2005).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada
bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan
pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus,
sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya
dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung (Dwidjoseputro, 2005).
Pengecatan gram dilakukan untuk membedakan bakteri berdasarkan
komponen penyusun dinding sel (Black & Black, 2014: 71). Bakteri Gram positif
memiliki struktur peptidoglikan yang tebal . Sementara itu, bakteri Gram negatif
memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis, dilengkapi dengan membran dalam dan
membran luar yang tersusun atas kompleks lipopolisakarida (LPS) (Brooks dkk.
2013: 27). Pengecatan gram menggunakan reagen crystal violet, iodin, ethanol
96%/ethanol aseton dan safranin (Black & Black, 2014: 69).
Pengecatan gram dimulai dengan preparasi olesan seperti pada pengecatan
sederhana. Selanjutnya olesan ditetesi dengan crystal violet yang berfungsi sebagai
reagen primer. Olesan lalu ditetesi dengan larutan iodin yang berperan sebagai
mordant sehingga crystal violet dapat berikatan dengan peptidoglikan. Selanjutnya
olesan dibilas menggunakan ethanol 96% atau campuran 50/50 ethanol dan aseton
untuk melarutkan lemak, yakni lapisan lipopolisakarida pada bakteri gram negatif.
Setelah itu, olesan kembali dicat menggunakan safranin yang berperan sebagai
counterstain (Kleyn & Bicknell, 2003: 37).
Pengecatan gram dapat membedakan 4 kategori bakteri berdasarkan
komponen dinding sel dan reaktivitasnya terhadap reagen yang digunakan (Black &
Black, 2014: 69). (1) Bakteri Gram positif yang memiliki lapisan peptidoglikan
yang tebal akan terwarnai menjadi ungu karena crystal violet terikat dalam jumlah
yang besar pada lapisan tersebut. (2) Bakteri Gram negatif akan terwarnai menjadi
merah muda karena crystal violet yang melekat pada lapisan lemak membran luar
larut oleh ethanol. Warna merah mudah yang didapatkan bakteri gram negatif berasal
dari safranin (Kleyn & Bicknell, 2003: 37). (3) Bakteri gram non-reaktif
merupakan bakteri yang tidak terwarnai oleh crystal violet maupun safranin. Dan (4)
bakteri Gram variabel merupakan bakteri yang terwarnai secara tidak konsisten
walaupun berasal dari biakan yang sama (Harley & Prescott, 2001: 44-45).
Struktur dinding sel bakteri berperan penting terhadap integritas selular, bentuk
dan stabilitas fisiologis. Sel Gram-positif memiliki dinding tebal yang terdiri dari
suatu jaringan multilayer peptidoglikan (sekitar 30-70% dari bobot total dinding sel)
yang terikat oleh membran bagian dalam. Sedangkan sel Gram-negatif memiliki
dinding relatif tipis dari peptidoglikan yang tersisip diantara dua membran (<10%
dari bobot total dinding sel). Membran bagian luar terdiri dari lipopalisakarida dan
lipoprotein. Membran bagian dalam dari kedua tipe Gram mempunyai tipikal struktur
dua lapis lemak/protein dari membran sitoplasmik (Ling, 1990).
Perbedaan relatif sifat bakteri Gram positif dan Gram negatif:
Sifat Bakteri Gram Positif Bakteri Gram Negatif
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi
(1-4%)
Kandungan peptidoglikan Peptidoglikan tinggi Peptidoglikan rendah
Ketahaan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambat oleh pewarna Lebih dihambat Kurang dihambat
basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanan terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik
(Manurung, 2010)
Pewarnaan gram dirintis oleh Cristian Gram yang bertujuan untuk
menentukan golongan bakteri atas bakteri gram positif dan gram negatif. Pada bakteri
Gram positif setelah pelunturan warna dengan alkohol, sel akan mengalami dehidrasi
dan terjadi pengerutan pori-pori. Hal ini menyebabkan permeabilitas membran sel
bakteri turun dan kompleks kristal violet iodium tidak dapat keluar dari sel. Pada
bakteri gram negatif, setelah pelunturan warna dengan alkohol, lemak akan
dikeluarkan dari dinding sel, akibatnya porositas membran meningkatdan kompleks
kristal violet iodium akan keluar dari sel (Hastuti, 2012).

Dinding sel bakteri Gram positif tebal yang terdiri dari peptidoglikan (50-
90%). Peptidoglikan terutama polisakarida terdiri dari dua subunit yaitu N-asetil
glukosamin dan N-asetil asam muramic. Sebagai lapisan yang berdekatan dari
peptidoglikan terbentuk, N-asetil glukosamin dan N-asetil asam muramic
dihubungkan oleh rantai pendek peptida dengan bantuan enzim transpeptidase,
sehingga dinding sel menjadi kaku. Lapisan peptidoglikan yang tebal memungkinkan
organisme untuk mempertahankan violet-iodine kompleks kristal. Asam lipoteikoat
(LTA) juga merupakan unsur utama dari dinding sel bakteri Gram-positif. Bakteri
Gram positif adalah adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna violet dan
memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Ciri–ciri bakteri Gram positif yaitu
homogen dan tebal (20-80 nm) sebagian besar tersusun dari peptidoglikan sebagian
lagi terdiri dari polisakarida lain dan asam teikoat, bulat, batang atau filamen. Bakteri
Gram negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna merah, dan
memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Ciri-ciri bakteri Gram negatif adalah
memiliki dinding tidak terlalu tebal (peptidoglikan) yang mengandung asam,
menghasilkan toksin bersifat endotoksin, dan tidak resisten terhadap pinisillin
(Karmana, 2008).
Bakteri Gram-negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (10% dari
dinding sel) dan mengalami kehilangan violet-iodine kompleks kristal selama
dekolorisasi dengan bilasan alkohol, tetapi dapat mempertahankan noda kontra
Safranin, sehingga muncul kemerahan atau merah muda. Bakteri gram negatif juga
memiliki membran luar tambahan yang berisi lipid, yang dipisahkan dari dinding sel
dengan cara ruang periplasma.

Struktur dinding sel bakteri Gram positif dan negatif

Sumber: Amrita, 2014

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut:

1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi
yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai
 berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram
positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit
dalam penetesan alkohol yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna
sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak
lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel
menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan
menampakkan gramvariabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan
sebagian merah karena pengaruh umur

Faktor-faktor lain yang juga dapat menimbulkan keragaman dalam reaksi Gram ialah
(Hadioetomo, R. S.1985:101):

C. ALAT DAN BAHAN :

ALAT BAHAN
- Kaca objek - Larutan Amonium Oksalat Kristal
- Kaca tutup Violet
- Pipet tetes - Larutan Safranin
- Mangkuk pewarna - Larutan Iodium
- Kawat penyangga - Lisol
- Pinset - Emersi
- Botol penyemprot - Biakan bakteri dari buah alpukat
- Lampu spirtus - Alkohol 70%
- Jarum ose - Aquades
- Mikroskop - Aquades steril
- Tisu
- Label
- Kertas lensa
- alumuniumfoi
- Korek api

D. PROSEDUR PENELITIAN
 Disediakan kaca
yang bersih, lalu
dilewatkan di atas Ditetesi dengan
Dibilas dengan
nyala lampu alkohol 75%,
aquades
spirtus tunggu 1 menit

Diteteskan setetes Ditetesi dengan

aquades steril larutan Iodium di Dibilas dengan
diatas benda kaca atasnya, tunggu 2 aquades
tersebut menit
Diambil inokulum bakteri Ditetesi dengan
alpukat, lalu diletakkan di Dibilas dengan larutan safranin,
atas tetesan aquades aquades tunggu 30 detik.
tersebut. Ratakan perlahan Lalu dibilas
hingga warna putih tulang
dan dikeringkan Diletakkan di atas kawat dikeringkan
Dilakukan fiksasi penyangga, dtetesi dengan tisu.
dengan cara larutan Amonium Oksalat Kemudian diamati
dilewatkan di atas Kristal Violet, tunggu 1 di mikroskop.
lampu spirtus menit
dengan cepat

E. DATA

Tabel Hasil Pengamatan Pewarnaan Gram pada Bakteri dari Buah Alpukat

No. Pengamatan Sifat Gambar

Koloni Warna Gram Bentuk sel
Ungu Merah Bakteri
A ✓ Gram Streptococcus
Negatif
 B ✓ Gram Coccus
Negatif

F. ANALISIS DATA

Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (dari buah alpukat) dengan tujuan
agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk
melekatkan mikroorganisme di kaca preparat, tujuan dilakukan fiksasi untuk
melekatkan bakteri diatas objek glass, membunuh mikroba secara tepat dengan tidak
merusak struktur selnya. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk memperkuat
warna pada bakteri. Alkohol 75% berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna
pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian satranin yang berfungsi untuk
memberi warna kembali pada bakteri yang telah kehilangan warna pada proses
pemucatan dengan menggunakan alkohol. Pada bakteri di preparat A dan B
menunjukkan warna merah. warna merah menunjukan bakteri gram negatif
dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah
berikatan dengan safranin. Bentuk bakteri koloni A adalah streptococcus dan koloni
B bentuk bakteri coccus.

G. PEMBAHASAN
Pewarnaan Gram pada bakteri yang terdapat di buah alpukat. Pewarnaan ini
didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak
sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
 Berdasarkan hasil pengamatan yakni pewarnaan Gram dan betuk sel bakteri.
Pada koloni A diperoleh Gram negatif dengan bentuk bakteri streptococcus,
sedangkan pada koloni B diperoleh Gram negatif dengan bentuk coccus . Bakteri
Gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran
sel, sehingga mudah berikatan dengan safranin. Bakteri Gram negatif memiliki
lapisan peptidoglikan yang tipis, dilengkapi dengan membran dalam dan membran
luar yang tersusun atas kompleks lipopolisakarida (LPS) (Brooks dkk. 2013: 27).

Pewarnaan Gram menggunakan 4 macam zat pewarna yaitu meliputi Kristal

Violet sebagai pewarna primer, Iodium sebagai pewarna sekunder, Alkohol
sebagai larutan pemucat, Safranin sebagai pewarna pembanding.

1. Larutan Crystal Violet

Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan
dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu).
2. Iodium
Merupakan pewarna Mordant, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian Iodium pada
pewarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
3. Alkohol
Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Memiliki peran ganda sebagai pelarut
lipida dan sebagai zat dehidrasi protein efektif (Subandi, 2010). Perannya
bergantung pada konsentrasi lipida dari
dinding sel mikroorgansime. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan :
 Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu
 Bakteri menjadi tidak berwarna
 Pada koloni A dan B sel bakteri Gram negatif dibagian luar lapisan dinding sel
terdapat konsentrasi lipid yang tinggi menyebabkan hilangnya kompleks kristal
violet-iodin. Konsentrasi lipida yang tinggi larut oleh alkohol yang menciptakan pori-
pori yang besar pada dinding sel. Hal itu akan menyebakan lepasnya zat kristal violet
iodin yang tidak terikat dan menyebabkan sel bakteri tersebut kehilangan warnanya
atau tidak berwarna.

4. Lawan warna (counterstain) yaitu safranin. Zat ini merupakan zat kimia terkhir
untuk mewarnai sel yang kehilangan warnanya oleh alkohol. Karena hanya pada
gram negatif yang luntur warnanya maka hanya gram negatif yang akan
menyerap/menerima zat warna safranin ini.

Pemberian alkohol menyebabkan lunturnya warna ungu dari dinding sel bakteri
gram negatif (dinding sel tidak berwarna lagi), maka penambahan larutan safranin
akan menyebabkan dinding sel kembali berwarna lagi, namun dengan warna merah
(safranin merupakan larutan berwarna merah).

Gambar .Teori teknik pewarnaan Gram (Talaro, 2002)

 Dapat dikatakan, bakteri Gram negatif merupakan jenis bakteri yang susah
untuk dimusnahkan karena memiliki struktur membrane luar (outer membrane)
pada dinding selnya yang menyebabkan bakteri ini lebih resistant terhadap
desinfektan maupun cairan kimia antimikroba lainnya (Talaro, 2002). Sel-sel Gram
negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid
pada umumnya larut dalam alkohol. Larutnya lipid oleh pemucatan yang digunakan
dalam pewarnaan Gram memperbesar pori-pori dinding sel da inilah yang
menyebabkan proses pemucatan pada sel-sel Gram negatif berlangsung lebih cepat
(Hadioetomo, R.S. 1985:100).

H. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan dan pengamatan yang dilakukan diperoleh kesimpulan
bahwa:
1. Pewarnaan yang digunakan menggunakan pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram
adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan
pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Berdasarkan hasil pewarnaan Gram diperoleh kedua koloni yakni bakteri Gram
negatif dengan indikator warna merah, pada koloni A dengan bentuk bakteri
streptococcus dan koloni B dengan bentuk coccus.

I. DISKUSI
1. Apakah fungsi fiksasi dalam pewarnaan Gram?
Fiksasi bertujuan untuk melekatkan bakteri diatas objek glass, membunuh
mikroba secara tepat dengan tidak merusak struktur selnya, membuat sel
lebih kuat, merubah afinitas cat, dan mencegah mengkerutnya globula–globula
protein sel. Hal ini sesuai dengan Karmana (2008) yang menyatakan bahwa
fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada
objek glass tanpa merusak struktur selnya.
2. Apakah fungsi larutan iodium dalam pewarnaan gram?
 Iodium merupakan zat yang digunakan dalam pewarnaan Gram, yaitu sebagai
pewarna mordan. Pewarna mordan adalah pewarna yang berfungsi memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Sifat dari iodin yaitu tidak berbau, berwarna
coklat, dan asam. Mekanisme kerjanya adalah Iodium yang banyak dan
kompleks zat iodine terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme Gram positif sedangkan lipid dari sel organisme Gram negatif
dengan pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Hal ini sesuai dengan
Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa iodine berfungsi untuk
mengikat zat warna primer agar tidak keluar dari sel bakteri.
3. Mengapa terjadi perbedan reaksi dan hasil pewarnaan Gram antara bateri gram
positif dan bakteri Gram negatif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi dalam
proses pewarnaan secara Gram!
Hadioetomo, R.S. (1985:100) menyatakan perbedaan yang terjadi pada bakteri
gram positif dan bakteri Gram negatif karena perbedaan susunan kimia dinidng
sel. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri Gram positif menyusut oleh
perlakuan alkohol karena terjadi dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding
sel menutup sehingga mencegah larutnya komleks ungu kristal-iodium pada
langkah pemucatan. Sedangkan sel-sel Gram negatif mempunyai kandungan
lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam
alkohol. Larutnya lipid oleh pemucatan yang digunakan dalam pewarnaan Gram
memperbesar pori-pori dinding sel da inilah yang menyebabkan proses
pemucatan pada sel-sel Gram negatif berlangsung lebih cepat. Dwidjoseputro
(2005) menyatakan Ion kristal violet akan berikatan dengan komponen negatif
pada sel bakteri sehingga berwarna ungu. Bakteri Gram negatif akan berikatan
dengan safranin dan berwarna merah. Tapi bakteri Gram positif tetap berwarna
ungu karena warna safranin tidak dapat masuk, terhalang oleh adanya kompleks
kristal violet-iodin.

Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 75%

 gram + : lipid < + alkohol 75% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein
dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)

gram - : lipid > + alkohol 75% pori dinding sel yang terbentuk besar, protein
dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)
 DAFTAR RUJUKAN

Amrita. 2014. Gram Stain Technique. (Online)

(http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=1), diakses pada 19
September 2018
Black, J. G. & Black, L. J. Microbiology: principles and explorations, 9th ed. John
Wiley & Sons, Inc. Danvers: xx + 940 hlm.
Brooks, G. F., Carroll, K. C., Butel, J. S., Morse, S. A., Mietzner, T. A. 2013. Jawetz,
Melnick & Adelberg’s medical microbiology 26th ed. The McGraw-Hill
Companies. Texas: xii + 864 hlm.
Dwidjoseputro. 1990. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Hadioetomo, R. S. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. PT. Gramedia:Jakarta.
Harley, J. P. & Prescott, L. M. 2001. Laboratory exercises in microbiology, 5th ed.
The McGraw-Hill Companies. Texas: ix + 466 hlm.
Hastuti,U. 2012. Materi dari dosen dalam bentuk power point: Pewarnaan dan
Pemeriksaan Bakteri. Malang: Universitas Negeri Malang.
Manurung, P. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. PT. Grafindo Media
Pratama:Jakarta.
Karmana. 2008. Biologi. PT. Grafindo Media Pratama:Jakarta.
Kleyn, John & Bicknell, Mary. 2003. Microbiology experiments: a health science
perspective, 4th ed. The McGraw-Hill Companies. Texas: ix + 349 hlm.

Ling, J.R. 1990. Digestion of bacterial cell walls in the rumen. In : The Rumen
Ecosystem (Eds: S. Hoshino, R. Onodera, H. Minato and H. Itabashi). Jap. Sci.
Soc. Press. Tokyo. 83 – 90.
Subandi, H. M. 2010. Mikrobiologi. PT Remaja Rosdakarya:Bandung.
Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press:Malang.
www.academia.edu/8884921/PEWARNAAN_BAKTER