BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya
dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998). Melihat
dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang
paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna yang mengabsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme
dengan sekelilingnya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkimkan pengamatan
struktur sel seperti spora, flagella dan bahan inklusi yang mengandung zat pati dan granua
fosfat. Pewarnan yang digunakan untuk melihat alah satu struktur sel disebut pewarnaan
khusus, sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilah organisme disebut
pewarnaan diferensial. Pewarnaan gram merupakan contoh pewarnaan diferensial yang
mmilah bakteri menjadi dua yaitu kelompok gram positif dan gram negatif (Lay W.
Bibiana.1994).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan.
Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Zat warna yang digunakan daam pewarnaan bersifat basa atau asam. Pada zat yang basa ,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai
muatan postif. Sebaliknya, pada zat warna asam, bagian yang memberikan zat
warna mempunyai muatan negatif. Zat warna yang basa lebih banyak digunakan karena
muatan negatif banyak ditemukan pada dinding sel, membrane sel sitoplasma sewaktu
proses pewarnaan. Muatan positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan
negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme jeas terlihat (Lay W. Bibiana.1994).
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja
serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994). Untuk mengidentifikasi suatu

biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik
melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram.
Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk
mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain
sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu
metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram
positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884.
Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan
lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu
mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi
dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian
bakteri. Diharapkan dengan percobaan ini,mahasiswa mampu melakukan berbagai
pewarnaan bakteri sesuai dengan peruntukannya.
1.2 Tujuan Praktikum
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah sebagai berikut :
1. Mengamati sel-sel bakteri dalam ukuran yang sebenarnya.
2. Mengenal dan mempelajari cara pewarnaan negative.
3. Untuk mengetahui teknik pewarnaan gram.
4. Untuk mengetahui morfologi sel bakeri yang digunakan saat praktikum.
5. Mengamati endospora dengan menggunakan prosedur pewarnaan.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Teori Dasar
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengabsobsi maupun
tidak mebiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme .Ada 4 teknik pewarnaa bakteri yaitu dengan cara :
Pewarnaan negatif atau pengecetan negatif adalah pewarnaan yang dilakukan bukan pada
mikrobanya melainkan pewarnaan tersebut ditunjukan pada latar belakang dari sel-sel
mikroba.

Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang tidak langsung. Kita hanya

mewarnai latar belakang dari bakteri tersebut, sedangkan bakterinya sendiri tidak
mengambil zat-zat warna. Pada negatif staining pada umumnya tidak dilakukan fiksasi,
maka praktis bakteri tidak mengalami perubahan-perubahan, tidak mengerut. Pada
pewarnaan bakteri ini sel-sel kuman kelihatan transparan (terang jernih) sedangkan latar
belakangnya kelihatan gelap (dengan tinta-cina). Pewarnaan negatif atau peawarna asam
dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif.
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin
yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
3. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif
tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah
atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini

berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pewarnaan Spora Bakteri sering
diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada

dalam keadaan hidup. Yang

dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat
pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998). Pada
umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan
adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan
untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel.
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif
2.2 Alat dan Bahan

No
1.

Tabel 2.1
Alat dan Bahan Teknik Pewarnaan Sederhana
Nama Alat
Ukuran Jumlah
Nama Bahan
Konsentrasi
Bak Pewarna
1
Biakan murni
-

2.

Bunsen

3.
4.
5.
6.

Kawat Ose
Gegep
Mikroskop
Aquades

No
1.
2.
3.
4.
5.

bacillus subtilis
Biakan murni

Escherichia coli
Kristal Violet
Lugol
Alkohol
95%
Aquades
Tabel 2.2
Alat dan Bahan Pada Teknik Pewarnaan Gram
Nama Alat
Ukuran
Jumlah
Nama Bahan Konsentrasi
Spiritus
1
Kristal violet
Gegep
1
Lugol
Mikroskop
1
Alkohol
95%
Korek Api
Glass
Cover

1
1
1

1 kotak

Air Suling
Minyak
imersi

Jumlah
1
1
1 tetes
1 tetes
1 botol

Jumlah
1 tetes
1 tetes
1-2 tetes
1 botol

1 tetes

1 tetes

6
Kawat Ose

Larutan
Safranin

.
No

Nama Alat
7. Kaca Preparat
8. Bak pewarna
9.
Stopwatch
10
Botol semprot
.

Ukuran
-

Jumlah
1
1
1

Nama Bahan
Bakteri A
Bakteri B
-

Konsentrasi
-

Jumlah
-

No
1.
2.
3.
4.
5.
6.

No
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Tabel 2.3
Alat dan Bahan Pada Teknik Pewarnaan Negatif
Nama Alat Ukuran
Jumlah
Nama
Konsentrasi
Bahan
Spiritus
1
Tinta Cina
Kawat Ose
1
Air Suling
Mikroskop
1
Bakteri B
Korek Api
1 kotak
Gegep
1
Bak
1
pewarna
Tabel 2.4
Alat dan Bahan Pada Teknik Pewarnaan Spora
Nama Alat
Ukuran Jumlah
Nama Bahan Konsentrasi
Spiritus
1
Malachite Green
5%
Kawat Ose
1
Air Suling
Mikroskop

Korek Api
Penjepit Kayu
Stopwatch
Botol semprot
Kaca preparat

1 kotak
1
1
1
1

2.3 Cara Kerja

2.3.1 Teknik Pewarnaan Sederhana

Alkohol
Larutansafranin
-

95%
0.5%
-

Jumlah
1 tetes
1 botol
-

Jumlah
1 tetes
1 botol
Bebera
pa tetes
1 tetes
-

No
.

Cara Kerja
No

Cara Kerja

Gambar

.
6.
1.

Siapkan alat dan bahan

Tetesi
kemudian,
kristal violet
hidupkan
kaca preparat tersebut
spiritus menggunakan
dan
korek
diamkan
api. selama 1 menit

Jepit kaca
7. preparat dengan gegep lalu
2.

sterilisasi kaca preparat

membolakSetelahdengan
1 menit
bilas dengan air suling dan
balikkan
ke spritus
keringkan.
Lalu lakukan semua langkah
untuk bakteri B

3.

Sterilisasi8.
kawat ose hingga kawat menjadi
kemerahan
Amati di Mikroskop

4.

Osekan bakteri A

Letakkan ke kaca preparat

5.

2.3.2 Teknik Pewarnaan Gram

No

Cara Kerja

hidupkan spiritus menggunakan korek api.

1.

Gambar

Gambar

No

Cara Kerja

.
Jepit kaca preparat dengan penjepit lalu
2.

sterilisasi dengan membolak balik ke api

Sterilisasi kawat ose hingga kawat menjadi

3.

kemerahan

Osekan bakteri A dengan cara zig-zag,

kemudian letakkan di kaca preparat
4.

Teteskan larutan kristal violet dan diamkan

5.

selama 1 menit.

6.

Bilas dengan air suling dan keringkan

setelah itu.

Gambar

No

Cara Kerja

Gambar

2.3.3
T

Teteskan larutan lugol 1-2 tetes dan

7.

diamkan selama 1 menit. Lalu bilas dengan

air suling kembali dan lakukan fiksasi

Selanjutnya, tambahkan alcohol 95%

8.

selama 45 detik, cuci, dan fiksasi kembali.

Setelah fiksasi, teteskan safranin dan

diamkan selama 30 detik, fiksasi kembali.
Setelah kering, tiriskan menggunakan kertas
serap dan teteskan minyak emersi. Amati
9.

menggunakan mikroskop. Setelah selesai,

lanjutkan dengan Bakteri B.

eknik Pewarnaan Negatif

No

Cara Kerja

hidupkan spiritus menggunakan korek api.

1.

Gambar

No

Cara Kerja

2.

Jepit kaca preparat dengan gegep lalu

sterilisasi kaca preparat dengan membolakbalikkan ke spritus

3.

Sterilkan kawat ose

Steril kan ose menggunakan bunsen hingga

warna kawat menjadi kemerahan, tunggu
4.

saat ose tidak terlalu panas ambil bakteri B

dan letakkan di tengah kaca preparat.

Teteskan tinta cina

5.

Gunakan kaca preparat yang telah steril.

Tarik, sehingga bentuk sebaran.
6.

Amati di Mikroskop

7.

Gambar

2.3.4 Teknik Pewarnaan Spora

No
Cara Kerja
.

Gambar

hidupkan spiritus menggunakan korek api.

1.

2.

Jepit kaca preparat dengan gegep lalu

sterilisasi kaca preparat dengan membolakbalikkan ke spritus
Sterilisasi kawat ose dan osekan biakan

3.

murni ke kaca preparat.

Teteskan malachite green 1-2 teteskan dan

4.

diamkan selama 1 menit

Bilas dengan air suling lalu di keringkan.

Teteskan larutan safranin. Diamkan, cuci,
5.

6.

3.1.
3.1.1

dinginkan.

Amati di mikroskop

BAB III
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengamatan
Teknik Pewarnaan Sederhana

No

Hasil Pengamatan

Gambar

Mikroba: Staphyloccus

3.1.2
P

Bentuk: Coccus
1.

Warna :Ungu/violet

Mikroba: Bacillus
2.

Bentuk: Batang
Warna :Ungu/Violet

ewarnaan Gram
No

Hasil Pengamatan

Gambar

Mikroba: Staphyloccus
Bentuk :Coccus
1.

Warna : Pink
Pewarnaan gram Negatif

Mikroba : Bacillum
Bentuk : Bacil
2.

Warna : Violet
Pewarnaan gram Positf

3.1.3

Pewarnaan Negatif
No

Hasil Pengamatan

.
Mikroba :Bacillum
1.

Bentuk : Batang
Warna : Putih

Gambar

3.1.4
P

ewarnaan Spora
No

Hasil Pengamatan

Gambar

Mikroba : Bacillum

Bentuk :Batang
1.

Letak spora : Pinggir bakteri

Spor

3.2 Pembahasan
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam
tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu
macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).
Pewarnaan negatif atau peawarna asam dapat terjadikarena senyawa pewarna bermuatan
negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena
itu sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan
nigrosin, asam pikrat dan eosin.
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahanbahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Dengan demikian pewarnaan negatif
berguna untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya serta berguna untuk
pengukuran-pengukuran bakteri. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Dari praktikum yang dilakukan, ditemukan bakteri bentuk coccus yang tidak terwarnai
(transparan) tetapi latar belakangnya hitam karena tidak menyerap zat warna yang diberikan
yaitu tinta cina.
Pada pewarnaan gram, mengamati sampel sampel A dan sampel B. Pada sampel A di amati
menghasilkan mikroba basilius sp berbentuk basil dengan warna merah sedangkan sampel B

menghasilkan mikroba streptococcus sp berbentuk coccus dengan warna ungu. Pada bakteri
yang berada di sampel A termasuk bakteri Gram negatif. Hal ini di sebabkan pada pemberian
alkohol pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah. Pada bakteri yang berada di sampel B
membentuk rantai dengan warna violet, sehingga bakteri ini termasuk bakteri Gram positif.
Hal ini disebabkan karena warnanya tidak terhapuskan oleh pencucian alkohol dan pemberian
alkohol ini membuat dinding sel bakteri terdehidrasi, pori pori mengkerut, serta daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga sehingga sel bakteri ini tidak menyerap
warna safranin yang merupakan warna kontras. Warna violet (ungu) ini timbul disebabkan
karena bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal dan kandungan
lipidnya rendah sehingga akan mengikat lebih banyak kompleks zat warna sehingga
warnanya menjadi violet (ungu). Pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun
sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam
langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel
bakteri., sebagai pewarna sekunder, Alkohol sebagai larutan pemucat,safranin sebagai
pewarna pembanding. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang
berada di antara dua lapis membran sel
Pewarnaan spora Berdasarkan pengamatan, yang terlihat ialah bakteri Bacillus
subtilisdengan spora yang terminal, yaitu letak spora ada diujung sel. Sebenarnya jenis letak
spora ada 3 buah: sentral, yaitu letak spora berada di tengah-tengah sel; terminal, yaitu letak
spora ada diujung sel; sub terminal, yaitu letak spora diantara ujung dan di tengah-tengah sel.
Pada pewarnaan spora, bakteri ini digunakan pewarna hijau malakit 5% dan safranin 0,5%.
Dalam prosesnya, larutan hijau malakit diteteskan di atas sediaan yang telah difiksasi,
kemudian dipanaskan. Pemanasan akan menyebabkan lapisan luar spora mengembang
sehingga pori-pori dapat membesar dan zat warna (larutan hijau malakit) meresap ke dalam
dinding pelindung spora bakteri. Proses selanjutnya adalah pendinginan, melalui pendinginan

ini warna hijau akan melekat di dalam spora. Warna hijau malakit ini berfungsi sebagai
indikator adanya spora bakteri. Sediaan yang telah didinginkan kemudian dicuci dengan air,
pencucian

ini

bertujuan untuk

menghilangkan

kelebihan

warna

hijau

malakit

sehingga pewarna kedua (safranin) dapat meresap pada sel vegetatif.

BAB IV
SIMPULAN
Pada praktikum teknik pewarnaan ini dapat disimpulkan:
1. Berdasarkan pengamatan dibawah mikroskop dengan menggunakan perbesaran 100 x
10, maka dapat disimpulkan bahwa pada sampel tersebut ditemukan bakteri berbentuk
coccus dan basillus.
2. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
3. Pada saat pewarnaan, kadar pewarna harus benar-benar diperhatikan kuantitasnya
4. dapat disimpulkan bahwa bakteri gram positif terdapat pada bakteri Bacillus sp karena
gram positif dapat mempertahankan warna awalnaya.sedangkan gram negatifnya
terdapat pada bakteri E-Colli, karena gram negatif kehilangan kompleks ungu kristal
pada waktu pembilasan dengan alkohol.
5. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk
membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering
digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri

gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan
berbeda.

DAFTAR PUSTAKA
Lay w. Bibiana.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.PT RajaGrafindo Persada:Jakarta.
DIASKDiakses pada tanggal 27 september 2016
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.
DIASKDiakses pada tanggal 27 september 2016
Dwidjoseputro, D.1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan
DIASKDiakses pada tanggal 27 september 2016

DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN............................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang...................................................................................................... 1
1.2 Tujuan Praktikum................................................................................................... 2
BAB II..................................................................................................................... 3
TINJAUAN PUSTAKA................................................................................................ 3
2.1 Teori Dasar........................................................................................................... 3
2.2 Alat dan Bahan...................................................................................................... 4
Cara Kerja................................................................................................................. 6
2.3.1 Teknik Pewarnaan................................................................................................ 6
2.3.1.1 Pewarnaan Sederhana......................................................................................... 6
2.3.1.2 Pewarnaan Gram............................................................................................. 7
2.3.1.3 Pewarnaan Negatif........................................................................................... 9
2.3.1.4 Pewarnaan Spora............................................................................................. 11
BAB III HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN....................................................12

3.1 Teknik Pewarnaan.............................................................................................. 12

3.1.1 Pewarnaan Sederhana....................................................................................... 12
3.1.2 Pewarnaan Gram............................................................................................. 12
3.1.3 Pewarnaan Negatif........................................................................................... 13
3.1.4 Pewarnaan Spora............................................................................................. 13
3.2 Pembahasan...................................................................................................... 13
BAB IV SIMPULAN................................................................................................. 16
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................. 17