Laporan Praktikum Mikrobiologi

Teknik Pewarnaan Bakteri

Oleh :
Nama : Nadia Riza Pratiwi

NIM : 1304617029

Kelompok :9

Tanggal Praktikum : 7 Oktober 2019

Dosen : Dr. Tri Handayani K, M. Si

Pendidikan Biologi A 2017

Jurusan Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Negeri Jakarta

2019
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Tujuan
1. Untuk mempelajari cara pewarnaan sederhana bakteri dengan satu pewarnaan bakteri
dengan warna (methylen blue), dan mengamati sifat set yang kontras dengan
sekelilingnya.
2. Untuk mempelajari cara pewarnaan Gram dan mengamati sifat dan bentuk bakteri
terhadap pewarnaan Gram.
3. Untuk mengetahui definisi dan fungsi dari fiksasi.
4. Untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri.
5. Untuk mengetahui macam-macam metode pewarnaan.
1.2 Latar Belakang
Bakteri adalah mikroba yang memiliki bentuk bervariasi seperti coccus, bacillus, dan
spiral. Dan pada umumnya, bakteri tidak memiliki pigmen sehingga bakteri tidak berwarna.
Untuk itu perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamatidengan
mikroskop (Dwidjoseputro, 1994).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan
pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada
umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang
tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk
mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati
struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang
diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Pewarnaan (stain) merupkan garam–garam yang tersusun atas ion positif dan ion
negatif, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromophone), bila kromofor
berada pada ion positif, disebut sebagai pewarna basa (basic dye) dan bila kromofor berada
pada ion negatif disebut sebagai pewarna asam (acidic dye) (Pratiwi, 2008).
Pewarnaan bakteri dipengaruhi beberapa faktor, yaitu:
1. Fiksasi
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar
tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi
 bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa
merusak struktur selnya (Lay,1994).
2. Peluntur zat warna
Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada
bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah
pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar
dilunturkan warnanya.
3. Substrata
Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa
tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat, lemak
dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang
diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill
dan sudanofil.
4. Intensifikasi warna
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu
zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena
zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu
mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan zat-
zat warna basa.Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat
warna asam.
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan
zat warna mula-mula yang digunakan.Gunanya adalah untuk memberikan warna pada
sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula.Zat warna penutup
diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel
yang tidak menyerap zat warna utama (Sutedjo, 1991).
Berikut ini adalah penjelasan dari beberapa cara pewarnaan bakteri antara lain
pewarnaan sederhana dan pewarnaan Gram :
1) Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan pada praktikum mikrobiologi. Disebut sederhana karena hanya
menggunakan satu jenis zatuntuk mewarnai mikroba yang akan diamati. Pada
umumnya bakteri mudah bereaksidengan pewarnaan sederhana, karena sitoplasmanya
bersifat basofilik atau suka dengan basa.Pewarnaan sederhana biasanya menggunakan
 pewarna tunggal yaitu metal biru,basic fuchsin dan kristal violet. Pewarnaan sederhana
bertujuan untuk memberikan kontrasantara bakteri dan latar belakang. Pewarnaan
sederhana dilakukan ketika kita inginmengetahui informasi tentang bentuk dan ukuran
sel bakteri.
2) Pewarnaan gram
Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri
gramnegatif berdasarkan sifat fisik kimia dinding sel bakteri. Pewarnaan menggunakan
pewarnautama kristal violet dan pewarna tandingan safranin. Tujuan pewarnaan ini
adalah untukmemudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan
bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding
sel dan vakuola, sertameningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Pewarnaan ini dapat membagi bakteri menjadi gram positif dan gram negatif
berdasarkan kemampuannya untuk menahan pewarna primer (kristal ungu) atau
kehilanganwarna primer dan menerima warna tandingan (safranin). Bakteri gram
positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam presentase
lebih tinggi dan dindingselnya tipis. Pemberian alcohol (etanol) pada praktikum
pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar
permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk kedalam sel dan menyebabkan
sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram
positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alcohol, pori-pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat
masuk sehingga sel menjadi berwarna ungu, yang merupakan warna dari kristal violet.
 BAB II
METODOLOGI

2.1 Alat dan Bahan

- Alat:
1. Mikroskop 8. Label
2. Object glass & cover glass 9. Kapas
3. Pipet 10. Korek api
4. Jarum ose 11. Spidol transparan OHP
5. Bunsen 12. Serbet
6. Batang gelas 13. Kantung plastik untuk sampah
7. Tisue 14. Minyak imersi
- Bahan:
1. Biakan murni bakteri
2. Larutan pewarna bakteri methylen blue
3. Larutan pewarna bakteri Gram.
- Gram A : Larutan pewarna bakteri Hucker's Crystal Violet
- Gram B : Larutan Mordan Lugol's Iodine.
- Gram C Larutan peluntur (Aceton-Alkohol)
- Gram D Larutan pewarna bakteri safranin.
4. Alkohol 70%
5. Aquadest steril
2.2 Cara Kerja
Sebelum melakukan isolasi meja harus di aseptiskan terlebih dahulu dengan cara
penyemprotan alkohol 70%. Bersihkan cover dan object glass nya dengan alkohol guna
menghilangkan kotoran serta lemak yang menempel di cover dan object glass dan di panaskan
di atas api untuk pengasetisan cover dan object glassnya.
2.2.1 Pewarnaan Sederhana
Pertama, objek glass dibersihkan dengan alkohol hingga bebas lemak, lalu dipanaskan
sekilas di atas nyala lampu spiritus. Selanjutnya, diambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri,
dan diratakan di atas object glass seluas 1 cm2, kemudian dikering-anginkan preparat apusan
tersebut. Setelah kering preparat lalu difiksasi dengan cara dipanaskan sekilas di atas nyala api
spiritus 6-7 kali dan di dinginkan. Lalu pada apusan diteteskan larutan pewarna bakteri
methylen blue, di diamkan 1-2 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa
pewama bakteri tercuci seluruhnya. Selanjutnya preparat dikering-anginkan. Terakhir diamati
di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat. Sel-sel bakteri akan tampak berwarna biru
dengan latar belakang terang.
2.2.2 Pewarnaan Gram
Pertama, object glass dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu suspensi bakteri diambil
dengan jarum ose kemudian diratakan. Lalu, diteteskan larutan Gram A sebanyak 2-3 tetes
pada apusan bakteri, kamudian dibiarkan selama 1 menit. Lalu, dicuci dengan air yang
mengalir, kemudian dikering-anginkan hingga kering, atau dikeringkan dengan kertas isap
secara hati-hati. Selanjutnya, diteteskan dengan gram B, dibiarkan selama 1 menit, dicuci
dengan air mengalir, di angin-anginkan hingga kering. Lalu, dicuci dengan Gram C (larutan
peluntur) selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, diangin-anginkan hingga kering.
Kemudian, diteteskan larutan gram D (larutan pewarna bakteri penutup), dibiarkan selama 2
menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Terakhir, diamati dibawah
mikroskop dengan perbesaran kuat.
 BAB III
HASIL & PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan

1. Lactobacillus sp

Perbesaran 40x10 Perbesaran 100x10

Pewarnaan sederhana Pewarnaan Gram.

2. Escherica coli

Perbesaran 100x10
Perbesaran 100x10
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Sederhana
3. Bacillus cereus

Perbesaran 100x10 Perbesaran 100x10

Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram

4. Salmonella typhiporium

Perbesaran 100x10
Perbesaran 100x10
Pewarnaan sederhana
Pewarnaan Gram
5. Bacillus pumilus

Perbesaran 100x10 Perbesaran 100x10

Pewarnaan sederhana Pewarnaan Gram

6. Bacillus thuringiensis

Perbesaran 100x10 perbesaran 100x10

Pewarnaan sederhana Pewarnaan Gram

3.2 Pembahasan
1. Lactobacillus sp

Dilihat dari gambar ini, bakteri Lactobacillus sp. merupakan bakteri Gram positif.
Ini dapat disimpulkan karena setelah dilakukan pewarnaan Gram, di dapat warna akhir
berwarna biru keunguan. Hal ini karena bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu di bawah mikroskop (Lay.1994).
2. Escherica coli
Dilihat dari gambar ini, bakteri Escherica coli merupakan bakteri Gram negatif. Ini
dapat disimpulkan karena setelah dilakukan pewarnaan Gram, di dapat warna akhir
berwarna merah agak jingga atau pink. Hal ini karena bakteri gram negatif akan kehilangan
zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna akan
tampak berwarna merah (Lay.1994).
3. Bacillus cereus
Dilihat dari gambar ini, bakteri Bacillus cereus merupakan bakteri Gram positif. Ini
dapat disimpulkan karena setelah dilakukan pewarnaan Gram, di dapat warna akhir
berwarna biru keunguan. Hal ini karena bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu di bawah mikroskop (Lay.1994).
4. Salmonella typhiporium
Dilihat dari gambar ini, bakteri Salmonella typhiporium merupakan bakteri Gram
positif. Ini dapat disimpulkan karena setelah dilakukan pewarnaan Gram, di dapat warna
akhir berwarna biru keunguan. Hal ini karena bakteri gram positif akan mempertahankan
zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu di bawah mikroskop (Lay.1994).
5. Bacillus pumilus
Dilihat dari gambar ini, bakteri Bacillus pumilus merupakan bakteri Gram positif. Ini
dapat disimpulkan karena setelah dilakukan pewarnaan Gram, di dapat warna akhir berwarna
biru keunguan. Hal ini karena bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal
violet dan akan tampak berwarna ungu di bawah mikroskop (Lay.1994).
6. Bacillus thuringiensis
Dilihat dari gambar ini, bakteri Bacillus thuringiensis merupakan bakteri Gram
negatif. Ini dapat disimpulkan karena setelah dilakukan pewarnaan Gram, di dapat warna
akhir berwarna merah agak jingga atau pink. Hal ini karena bakteri gram negatif akan
kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat
pewarna akan tampak berwarna merah (Lay.1994).
 BAB IV
KESIMPULAN & SARAN

4.1 Kesimpulan
 Pemberian warna bakteri dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarnaan pada
lapisan tipis atau dioleskan yang sudah difiksasi dinamakan pewarnaan sederhana,
lapisan tadi digenangi dengan lapisan pewarna selama jangka waktu tertentu
kemudian lapisan itu dicuci dan dikeringkan, biasanya sel-sel itu terwarnai secara
merata akan tetapi, pada beberapa organisme terutama zat warna itu metilen blue.
Sel-sel bakteri akan tampak berwarna biru dengan latar belakang terang.
 Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram
positif berwarna ungu karena dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta
perbadaan terjadi pada dinding selnya, sedangkan pada gram negatif berwarna merah.
 Fiksasi adalah proses sebelum pewarnaan yang dilakukan dengan cara fisik
(pemanasan atau freeze drying), atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan
menggunakan agensia kimia. Fungsi fiksasi ialah mencegah mengkerutnya globula-
globula protein sel, mengubah afinitas pewarna bakteri, dapat membunuh bakteri
secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau
strukturnya, melekatkan bakteri diatas gelas benda.
 Faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri ialah fiksasi, substrat, intensifikasi
pewarnaan, pelunturan pewarna bakteri (decolorizer).
 Macam-macam metode pewarnaan adalah pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif
dan pewarnaan Gram.

4.2 Saran
Dalam pratikum selanjutnya sebaiknya dilakukan percobaan pewarnaan dengan
metode yang lain, seperti pewarnaan negatif, pewarnaan acid-fast agar pratikan dapat
mengetahui lebih banyak tentang pewarnaan.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Djambatan.

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.

Lay, Bibiana.W.1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali.

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobilogi Farmasi. Yogyakarta: EMS.

Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.
Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.