BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya karena tidak

mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat

warna digunakan untuk mewarnai mikroba atau latar belakangnya zat warna

mengadsorbsi atau memberiaskan cahaya sehingga kontramikroorganisme dengan

sekelilingnya ditingkatkan/prnggunaan zat memungkinkan pengamatan struktur

sel seperti spora flagella dan bahan inklusi yang mengandung zat pati dan granula

pospat.

Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut

pewarna khusus, sedangkan pewarna yang digunakan untuk memilahkan

mikroorganisme disebut disebut pewarna diferensial. Pewarnaan gram merupakan

contoh pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok tahan

asamdan tidak tahan asam.

1
1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah pada percoban ini adalah bagaimana

cara mengamati mikroorganisme dengan menggunakan pewarnaan pada

sampel yang digunakan.

1.3 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan

memahami cara-cara pewarnaan mikroorganisme pada sampel yang

digunakan.

1.4 Tujuan Percobaan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk:

a. Metode pewarnaan apa saja yang akan digunakan dalam pewarnaan

mikroorganisme

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori Umum

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat asam atau basa. Pada

zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut komodor

yang mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam, sebagian yang

berperan dalam memberikan zat warna muatan negatif banyak ditemukan pada

dinding sel. Membrane sel dan sitoplasma sewaktu proses pewarnaan. Muatan

positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel.

Sehingga mikroorganisma lebih jelas terlihat.

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk

mewarnai mokroorganisma, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar

belakang sediaan pewarnaan zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak

dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadang

kala zat warna nwgative ini digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan

positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap

struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses

pewarnaan.

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme

disebut pewarnaan positif. Dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat

warna basa yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan

negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negarive latar belakang sekeliling

3
mikroorganisma diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme

yang tidak bewarna.

Pewarnaan ini secara kimiawi dengan protoplas bakteri, apabila sel belum

mati, proses pewarnaan akan membunuhnya. Proses ini merupakan proses yang

cepat dan menghasilkan sesuatu artefak.

Pewarnaan yang umum dipakai adalah garam. Pewarnaan dasar terdiri dari kation

berwarna dan anion tak berwarna (Mid : metilen biru,klorida)

Pewarnaan asam merupakan kebalikannya (sodium.eosinate) sel bakteri

kayak asam amino dan mengandum muatan negatif seperti kelompok fosfat.sifat

ini bereaksi degan zat warna yang bermuatan positif.pewarnaan asam tidak

mewarnai sel bakteri oleh karenanya digunakan untuk mewarnai latar belakang

sebagai warna kontras.

Pewarnaan bisa mewarnai sel bakteri secara erat.kecuali sitoplasma RNA

sirsak terlebih dahulu teki pewarnaan khusus bisa digunakan untuk membedakan

flagella,kapsul,dinding sel,membran sel,granula,nukleoid dan spora

Pewarnaan dibagi atas beberapa macam yaitu :

a.pewarnaan garam

b.pewarnaan negatif

c.pewarnaan sederhana

d.pewarnaan tahan asam

4
 A. Pewarnaan Gram

Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap

pewarnaan garam.pewarnaan garam menjadi penting karena reaksi garam

berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan

filogenik.organisme yang berpotensi garam positif mungkin hanya dapat dilihat

dengan pewarnaan garam pada kondisi lingkungan yang sesuai dan biakan muda.

Perbedaan pada tahapan pewarnaan garam disebab Ian oleh :

a. Aperbedaan struktur dinding sel bakteri gram positif dan garam

negatif,sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat

warna dan penambahan larutan pemucat.sebagai dasar dinding sel bakteri

gram positif terdiri dari peptidoglikan,sedangkan dinding sel bakteri gram

negatif mempunyai kandungan lipida yang lebih tinggi.lipida ini akan larut

dalam alkohol dan aseton yang akan digunakan sebagai pemucat,sehingga

pori-pori dinding sel membesar dan meningkaatkan daya larut kompleks

kristal violet-iodin pada dinding sel bakteri gram negatif

b. Perbedaan bakteri gram positif akan terbentuk persenyawaan kompleks

kristal violet-iodine ribonuklet yang tidak larut terbentuk pada bakteri

gram negatif sehingga diduga adanya perbedaan kandungan asam

ribonukleat antara bakteri gram negatif dengan gram positif.

5
 B. Pewarnaan Negatif

Pewarnaan negatif untuk lihat adanya kapsul disekeliling

mikroorganisme.prosedur ini meliputi pewarnaan latar belakang dengan

pewarnaan asam dan membiarkan selsel tidak berwarna (sel-sel tidak berwarna

latarnya berwarna) pewarnaan hitam nigrisin merupakan yang umum

digunakan.metode ini digunakan pasase atau struktur sel yang sulit diwarnai

secara langsung.

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat yang bersifat basa,tetapi

mudah dilihat dengan pewarnaan negatif.pada metode ini mikroba dicampur

dengan nigrosin,kemudian digesekkan diatas kaca obyek.zat warna tidak akan

mewarnai bakteri,akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri.degan

mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna Adnan latar belakang hitam,

Ciri-ciri pewarnaan negatif :

1.Menggunakan zat warna bermuatan negative

2. Penggunaan zat warna negatif ini,menyebabkan zat warna tidak akan mewarnai

permukaan sel yang bermuatan negative

3.pewarnaan ini bukan merupakan pewarnaan sel bakteri,karena sel bakteri tetap

tidak berwarna setelah penambahaan zat warna

4.kesalahan yang sering dilakukan adalah

5.preparat ulas terlalu tebal sehingga lingkungan disekelilingnya bakteri terlihat

gelap dan mikroba dapat dibedakan dengan lingkungan sekelilingnya

6
6.preparat ulas terlalu tipis sehingga tidak terjadi kontras yang tajam antara

bakteri dengan lingkungan di sekitarnya

C. Pewarnaan Sederhana

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan 1 macam warna untuk

meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya lazimnya

prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti kristal

violet,metilen iri karbol fuksin basa,safranin atau hijau malakit

.kadangkala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana zat

warna yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah Kongo

D.Pewarnaan tahan asam

Bakteri tahan asam adalah mereka yang mengikat karbol

fuksin,meskipun didekolorisasi degan asam klorida (HCL) dalam

Alcoholl.selaput tipis Le pada silde digenangi oleh karbol fuksin dan

dipanasi degan uap panas selanjutnya dilakukan dekoloraisasi degan asam

alcohol ,dan terakhir diberi warna kontras (counter strain),biru atau

hijau.bakteri tahan asam akan tampak merah,yang lainnya akan sesuai

warna counterstrai.

Pewarnaan ziehl-neelsen atau pewarnaan tahan asam memiliahkan

kelompok mycobacterium dan nocardia dan bakteri lainnya.pada ke 2

kelompok tersebut terdapat bakteri yang patogen,yaitu micobaterium

tuberkulosis, M lepra dan Nocardia Asteroides M.

7
 Kelompok bakteri ini disebut tahan asam karena mempertahankan

zat warna pertama (karbol Fuksin) sewaktu dicuci degan larutan pemucat

pada pewarnaan ini mengandum asam dan Alcohol.bakteri tahan asam

terlihat berwarna merah,sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan

asam,larutan pemucat akan melarutkan fuksin-karbon dengan

cepat,sehingga sel bakteri tidak berwarna.setelah penambahan zat warna

kedua bakteri tidak tahan asam berwarna biru.

8
 BAB III

METODE KERJA

3.1 Alat dan Bahan

A. Alat

1. Gelas objek

2. Jarum ose

3. Kaca preparat

4. Bunsen

5. Mikroskop

6. Pipet tetes

B. Bahan

1. Biakan murni Staphylococcus Aureus

2. Biakan murni Phseudomonas

3. Larutan methylene blue

4. Alcohol 70%

5. Aquadest Steril

6. Spiritus

7. Tissue

9
3.2 Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja yang dilakukan pada percobaan ini adalah :

1) Mensterilkan kaca preparat dengan Alkohol 75%.

2) Mengeringkan (mengelap) kaca preparat dengan tissue.

3) Mengambil inoculum/biakan Staphylococcus Aureus dengan jarum ose

dan meletakan diatas kaca objek.

4) Memfiksasi kaca objek diatas Bunsen, kemudian menetesinya dengan

methylene blue, dan membiarkannya selama 3 menit.

5) Alirkan sisa methylene blue dengan aquadest hingga zat warnannya

hilang.

6) Mengeringkan kaca preparat dengan tissue.

7) Mengamati objek dibawah mikroskop dan mencatat hasil pengamatan.

10
 NO Nama Warna Bentuk

Bakteri koloni Koloni

1. Staphylococcus Aureus

Putih susu Bulat

Atau bergerombolan

Agak krem seperti buah

anggur

2. phseudomonas

Biru Berbentuk

Kapsul

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan Pewarnaan Baketri

11
4.2 Pembahasan

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen,sehingga tidak berwarna dan

hampir tidak terlihat karena tidak kontras dengan media dimana mereka hidup.

Oleh karena itu,perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati

dengan mikroskop. Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa

pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling

umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri seperti

coccus,bacillus,dan sebagainya dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna

sederhana,yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya menggunakan satu macam zat

warna saja.

Hal pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara di

celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan ke dalam alcohol

90%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua

mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan

digunakan. Setelah melakukan sterilisasi,kemudian melakukan pengolesan bakteri

pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada pembakar spiritus

yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak

tercampur dengan bakteri yang akan di uji. Sebelum melakukan pengolesan

bakteri kaca objek di beri tanda area untuk melakukan pengolesan sel bakteri dari

suspensi. Pada percobaan kali ini pengolesan di lakukan dengan sampel bakteri

Staphylococcus Aureus dan Pseudomonas menggunakan metilen blue.

Kemudian melakukan pengolesan pada kaca objek dengan salah satu sampel

Staphylococcus Aureus dan Pseudomonas. Setelah itu difiksasi di atas api dengan

12
cara di lewat-lewatkan tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati. Fiksasi

dalam tahap ini bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak

struktur selnya, mempermudah pengecetan dan sediaan tahan untuk disimpan jika

belum sempat di cat. Kaca objek yang sudah dioleskan bakteri kemudian ditetesi

metilen blue dan menunggu selama 3 menit kemudian dialirkan sisa metilen blue

dengan aquadest,setelah itu di seka sisa air dengan tisu kemudian ditutupi dengan

deg glass lalu di amati bentuk sel bakteri pada mikroskop.

Setiap akhir pemberian reagen dan pewarna,selalu dilakukan pembilasan

terhadap kaca objek dengan menggunakan aquadest. Pembilasan ini bertujuan

untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.

13
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum kali ini kami dapatkan simpulkan bahwa

pewarnaan digunakan untuk membedakan mikroorganisme,khusus bakteri

yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negative.

B. Saran

Saran dari praktikum kali ini yaitu alat yang digunakan di

laboratorium dapat berfungsi dengan baik, misalnya mikroskop.

14