Anda di halaman 1dari 18

BAB I PENDAHULUAN 1.

1 Latar Belakang Pengenalan bentuk (morfologi) mikroba, kecuali untuk kelompok mikroalga, harus dilakukan melalui pewarnaan terlebih dahulu. Karena tanpa melalui pewarnaa bentuk tersebut tidak akan dapat diamati secara jelas. Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan secara langsung bersama (bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarna tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif atau negatif. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarna yang bermuatan positif, misalnya metilen biru, hasil pewarnaan akan jelas. Secara kimia, zat warna dapat digolongkan dalam senyawa basa dan senyawa asam. Jika warna terletak pada muatan positif maka senyawa tersebut dinamakan zat warna basa. Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan negatif maka senyawa tersebut dinamakan zat warna asam. Contoh zat warna basa misalnya : metilen biru, safranin, merah netral dan sebagainya, dengan anionnya adalah Cl-, SO2-4, CH3COO-, CO-OHOO- dan sebagainya. Sedang zat warna asam misalnya Na eosinat, eosin, fukhsin, fukhsin asam, merah kongo dan sebagainya, dengan kationnya adalah Na+, K+, Ca2+, NH3+.

-1-

Di samping zat warna asam dan zat warna basa juga didapatkan zat warna indiferen seperti suddan III, dimetil amid azo benzol dan zat warna netral seperti eosin metilen biru. Salah satu sifat dan zat warna asam pada umumnya mempunyai sifat bersenyawa lebih cepat dengan bagian-bagian sitoplasma, sedang zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pada praktikum kali ini dilakukan untuk mengamati bentuk morfologi mikroba percobaan ini agak rumit karena warna mikroba yang diamati cenderung bening maka dilakukan pewarnaan agar lebih mudah diamati bentuk morfologinya. 1.2 Tujuan Percobaan Mengetahui jenis-jenis pewarnaan dan cara-cara pewarnaan Mengetahui tujuan dari pewarnaan Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan

-2-

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 1. Pewarnaan Sederhana Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan hanya 1 macam zat warna saja agar meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk, ukuran dan penataan mikrooragnisme. Pada bakteri dikenal berbagai bentuk, yaitu bulat (coocus), batang (basilus) dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coocus dapat terlihat penataan seperti rantai (streptokokus), buah anggur (stafilakokus), pasangan (diplokokus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 kokus (sarcinae). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coocus, basilus, vibrio, spirilum, dan sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Disamping itu dapat pula diamati struktur-struktur tertentu seperti endospora. Berbeda dengan spesimen hidup, sel-sel yang diwarnai terfiksasi pada kaca obyek sehingga dapat disimpan sebagai dokumentasi untuk jangka waktu lama. 2. Pewarnaan Negatif

-3-

Seperti jelas tercemin dari namanya, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi hanya mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Metode ini meliputi pencampuran mikroorganisme di dalam setetes tinta nigrosin lalu menyebarkannya di atas sebuah kaca obyek yang bersih. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang) dan tampak jelas di anatara medan yang gelap karena pewarna-pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Berbeda dengan metode-metode pewarna lain, pada pewarnaan negatif olesan tidak mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan sel dan salah bentuk agak kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih cepat. Akan tetapi harus diperhatikan bahwa selama mengeringnya pewarna, sel-sel tersebut dapat saja mengalami penyusutan atau salah bentuk. Metode ini juga berguna untuk bakteri-bakteri tertentu, seperti spiroketa, yang sukar diwarnai Metode yang akan dipakai di sini menggunakan nigrosin. Berhasilnya metode ini bergantung pada hal-hal berikut: (1) kaca obyek harus betul-betul bersih ( bila terdapat sisa-sisa lemak atau debu pada kaca obyek, olesan mikroorganisme tidak akan merata); (2) jumlah nigrosan yang digunakan menentukan keberhasilan pewarnaan (kebanyakan mahasiswa cenderung untuk menggunakannya dalam jumlah yang berlebihan); (3) campuran mikroorganisme dan pewarna harus diseret di atas kaca obyek, bukan sekedar didorong. Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Pada metode ini mikroba dicampur dengan nigrosin, kemudian digesekkan di atas kaca obyek. Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop, mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam. Pada metode ini preparat tidak dipanaskan di atas api, melainkan dikeringkan di udara. Ciri-ciri pewarnaan negaif, yaitu : a. Menggunakan zat warna bermuatan negatif.

-4-

b. c. d.

Penggunaan zat warna bermuatan negatif ini, menyebabkan zat warna tidak akan mewarnai permuakaan sel yang mempunyai muatan negatif. Pewarnaan ini bukan merupakan pewarnaan sel bakteri, karena sel bakteri tetap tidak berwarna setelah penambahan zat warna. Kesalahan yang sering dilakukan: Preparat ulas terlalu tebal sehingga lingkungan di sekeliling bakteri terlihat gelap dan mikroba tidak dapat dibedakan dengan lingkungan di sekelilingnya. Preparat ulas terlalu tipis sehingga tidak terjadi kontras yang tajam antara bakteri dengan lingkungan di sekitarnya.

3.

Pewarnaan Gram Pada tahun 1884, seorang bakteriologiwan Denmark Christian Gram secara

kebetulan menemukan prosedur pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar yaitu : a. Organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu ), disebut gram positif. b. Organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktiu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan , safranin (sel-sel tampak merah muda ), disebut gram negatif. Karena kemampuannya untuk membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, pewarnaan gram disebut juga pewarnaan diferensial. Sekalipun mekanisme yang tepat dari pewarnaan Gram masih belum jelas, diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri Gram positif berbeda dari bakteri Gram negatif dan ini diduga berperanan dalam terjadinya reaksi Gram yang berbeda-beda. Faktor faktor yang juga dapat menimbulkan keragaman dalam reaksi gram ialah : a. Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan. b. Kerapatan sel terhadap olesan.

-5-

c.

Konsentrasi dan umur reagen-reagen yang digunakan untuk pewarnaan gram.

d. Sifat , komsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai. e. Sejarah biakan 4. Pewarnaan Spora Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong ke dalam genus Bacillus dan Clostridium, membentuk suatu struktur di dalam sel pada tempattempat yang khas, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrient, tahan terhadap panas dan unsur-unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi ultraviolet serta terhadap bahan-bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak membentuk spora. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dank eras. Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten yang diketahui sejauh ini; organisme yang bersangkutan dapat bertahan dalam debu dan tanah selama bertahun-tahun. Misalnya, adanya endospora dalam debu menjelaskan mengapa Bacillus merupakan kontaminan umum dalam laboratorium. Sifat endospora yang demikian itu menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Prosedur pewarnaan Gram misalnya, tidak dapat mewarnainya. Hanya bila diberi perlakuan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi, sekali pewarna tersebut memasuki endospora, sukar dihilangkan. Ada dua metode yang umum dipakai, yaitu metode Schaeffer-Fulton dan metode Dorner. Yang akan anda pakai disini adalah metode yang pertama (lihat prosedur). Metode Dorner menggunakan nigrosin dan menghasilkan spora berwarna merah dan sporangium yang tak berwarna. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya. Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan-panas dan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Contoh bakteri pembentuk spora adalah Bacillus, Clostridium, Thermoactinomyces, dan Sporosarcina. Spora terbentuk dalam sel

-6-

sehingga seringkali disebut sebagai endospora ; dalam sel bakteri hanya terdapat 1 spora. Spora ini tidak berfungsi untuk reproduksi. Dalam lingkungan yang menguntungkan spora bergerminasi kembali menjadi seperti vegetatif, sebaliknya jika tidak menguntungkan sel vegetatif berubah menjadi spora. Lingkungan yang tidak menguntungkan disebabkan langkanya sumber karbon, energi, atau fosfat. Selain itu bahan yang bersifat toksik, suhu yang tidak sesuai, atau lingkungan yang kering (hipotonik) menginduksi pembentukan spora. Spora tahan terhadap suhu dan bahan kimia yang mematikan sel vegetatif. Sebagai contoh, spora Clostridium botulinum tahan terhadap suhu mendidih selama beberapa jam. Kekeringan dan kekurangan zat hara tidak menyebabkan kematian spora; spora dapat bertahan dalam tanah selama puluhan tahun. Spora juga tahan terhadap sinar ultra violet dan antibiotika yang mematikan sel vegetatif. Lingkungan yang menguntungkan menggertak spora menjadi sel vegetatif; proses ini disebut germinasi . Germinasi ditandai kepekaan terhadap suhu panas, bahan toksik dan kimiawi, antibiotik dan sinar ultra violet. Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sukar diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan dipanaskan. Pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna dapat masuk.

-7-

BAB III METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat 3.1.2 Objek gelas Lampu bunsen Mikroskop Jarum ose Pipet tetes Cawan Petri Penjepit Kayu

Bahan Aquadest Media Biakan Bakteri Bacillus sp dan Escherichia Coli Larutan Basic Fuschsin Larutan Tinta Cina Larutan Crystal Violet Larutan Lugols Iodine Alkohol 95 % Larutan Safranin

-8-

Kertas Saring Larutan Malachite Green

3.2 Cara Kerja 3.2.1 Pewarnaan Sederhana 1. Dibersihkan objek gelas dengan alkohol sampai bebas lemak, kemudian difiksasi diatas nyala lampu spiritus. 2. Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas objek gelas seluas 1 cm2. 3. Dikeringkan, dianginkan preparat tersebut hingga membentuk noda. 4. Setelah kering difiksasi dengan cara dipanaskan diatas nyala lampu spirtus. 5. Setelah dingin diteteskan pada noda larutan zat warna sebanyak 1 2 tetes, dan biarkan selama 1 atau 2 menit. 6. Dicuci dengan air mengalir sampai sisa sisa zat warna tercuci seluruhnya. 7. Selanjutnya preparat dikeringkan, dianginkan. 8. Diamati di bawah mikroskop, sel sel bakteri akan tampak berwarna merah (ungu) dengan bentuk bentuk bakteri tersebut. 9. Digambar bentuk bentuk bakteri tersebut. 3.2.2 Pewarnaan Negatif 1. Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian difiksasi diatas nyala lampu spiritus. 2. Setelah dingin, diambil suspensi biakan murni Bacillus sp dengan ose secara aseptis dan diletakkan diatas objek gelas. 3. Kemudian diambil sedikit zat warna tinta cina dengan batang gelas dan dicampur dengan suspensi bakteri yang telah diletakkan diatas objek gelas.

-9-

4. Campuran bakteri dengan larutan tinta cina ini kemudian diratakan dengan batang gelas hingga merupakan lapisan yang tipis sekali. 5. Selanjutnya preparat dikeringkan, dianginkan. 6. Diamati di bawah mikroskop dengan kuat, sel sel bakteri akan tampak transparant dengan latar belakang hitam (gelap). 3.2.3 Pewarnaan Gram 1. Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian difiksasi diatas nyala lampu spiritus. 2. Diambil secara aseptik 1 ose suspensi bakteri dan diletakkan pada objek gelas. Setelah itu diratakan campuran suspensi bakteri tersebut. 3. Dikeringkan, dianginkan dan selanjutnya dilakukan fiksasi diatas nyala lampu spiritus. 4. Setelah dingin dibubuhkan zat warna utama yaitu crystal violet sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 1 menit. 5. Dicuci dengan air mengalir dan kemudian dikeringkan, dianginkan. 6. Diteteskan dengan larutan lugol dan biakan selama 1 menit dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, dianginkan. 7. Kemudian dicuci dengan alkohol 95 % selama 30 detik, selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, dianginkan. 8. Diberi larutan basic fuchsin atau safranin selama 2 menit. 9. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, dianginkan. 10. Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Disini diamati mana bakteri gram positif dan mana bakteri gram negatif atau bakteri gram variabel. 3.2.4 Pewarnaan Spora 1. Dibuat preparat ulas lalu ditutup dengan secarik kertas saring 2. Diteteskan 2-3 tetes malachite green 3. Dilewatkan slide di atas api selama 5 menit hingga uap terlihat dan tidak sampai mengering 4. Diamkan selama 1 menit kemudian dibuang kertas saring dan dibilas dengan akuades

- 10 -

5. Diteteskan safranin selama 30 detik dan dikeringkan tanpa difiksasi 6. Diamati di bawah mikroskop spora akan berwarna hijau, dan bagian lainnya atau sel vegetatif berwarna merah.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN


4.1 Hasil Pengamatan Setelah dilakukan pewarnaan, didapatkan hasil sebagai berikut : 1. Pewarnaan Sederhana Keterangan Bakteri Warna Bentuk : Bacillus subtilis Sp : Ungu : Batang

Perbesaran : 1000 x

2. Pewarnaan Negatif Keterangan Bakteri Warna : Bacillus subtilis Sp : Latar belakang gelap Warna bakteri transparan

- 11 -

Bentuk

: Batang

Perbesaran : 1000 x

3. Pewarnaan Gram Keterangan Bakteri Bentuk : Bacillus subtilis Sp Warna : Batang : Ungu

Perbesaran : 1000 x Bakteri gram positif

Keterangan Bakteri Warna Bentuk : Escherichia coli Sp : Kemerah-merahan : Bulat

Perbesaran : 1000 x Bakteri gram negatif

- 12 -

4. Pewarnaan Spora Keterangan Bakteri : Bacillus subtilis Sp Warna : Hijau merupakan bagian spora Merah merupakan bagian dari sel vegetatif Bentuk : Batang Perbesaran : 1000 x

4.2 Pembahasan Sesuai dengan jenisnya, pewarnaan terhadap mikroba ada dua kelompok besar, yaitu :

- 13 -

1. Pewarnaan tunggal atau pewarnaan sederhana, yaitu cara pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis pewarna saja, misalnya dengan metilen biru, gentiana violet, fuhsin basa dan safranin. 2. Pewarnaan bertingkat yaitu cara pewarnaan dengan menggunakan beberapa jenis pewarna secara bertahap. Ini mengingat bentuk dan sifat sel mikroba yang berbeda penerimaannya terhadap pewarna, sehingga pada akhirnya cara pewarnaan bertingkat ini dapat pula dipergunakan sebagai salah satu cara untuk membedakan kelompok mikroba. Adapun tujuan dari pewarnaan adalah : 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi ataupun jamur. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad. 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam. 4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. Ada beberapa faktor-faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba adalah : 1. Fiksasi Yang dilakukan sebelum zat warna digunakan. Dimana fiksasi ini bertujuan untuk : 1. Melekatkan sel pada gelas objek. 2. Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada sel dalam keadaan hidup. 3. Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif NH3 yang akan bereaksi dengan gugus OH- dan zat warna. 4. Mencegah terjadinya otolisis sel, yang proses pecahnya sel yang disebabkan oleh enzim yang ada di dalamnya. 5. Merubah daya ikat zat warna. Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun pengeringan secara dingin, sedang yang paling umum dilakukan secara kimia dengan penambahan sabun, formalin, fenol dan sebagainya. 2. Peluntur warna

- 14 -

Bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga dengan jelas dapat dilihat di bawah mikroskop misalnya, sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan, sedang sebaliknya sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk dilunturkan. 3. Substrat Yang berhubungan dengan kandungan sel yang terdiri dari karbohidrat, protein, lemak dan asam nukleat. Zat warna asam ataupun basa yang dapat bereaksi dengan isi sel akan dipengaruhi oleh kehadiran senyawa diatas, apakah menjadi cepat atau lambat. Sehingga berdasarkan komposisi selnya, sel tersebut dapat dibagi menjadi sel yang asidofilik, sel basofilik dan sel sudanofilik. Ini berarti bahwa sel asidofilik dapat mengikat zat warna asam, sel basofilik dapat mengikat zat warna basa dan sudanofilik yang larut dalam minyak. 4. Intensifikasi pewarnaan Bermaksud untuk mempercepat pewarnaan mikroba, misalnya dengan penambahan mordan, sehingga zat akan terikat lebih kuat dalam jaringan. Mordan juga sesuai dengan sifatnya terbagi menjadi mordan asam, yaitu yang dapat bereaksi dengan zat warna basa, missal asam tannin dan asam pikrat. Kedua mordan basa, yaitu yang dapat bereaksi dengan zat warna asam, missal FeSO4, K-antomonium, asetil pirimidnium khlorida. Selain dengan penambahan mordan, intensifikasi dapat pula dilakukan dengan meningkatkan zat warna, temperatur pewarnaan, missal antara 60 900C. 5. Zat warna penutup Yang diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan warna kontras pada sel mikroba yang diwarnai yang tidak menyerap warna mula. Misal metilen biru, safranin eritrosin dan sebagainya. Hasil pengamatan pada pewarnaan sederhana pada bakteri Bacillus subtilis Sp, didapatkan bentuknya seperti batang dengan warna ungu. Sedangkan pada pewarnaan negatif dengan bakteri yang sama, didapatkan warna bakteri tetap bening, namun terlihat bentuknya batang karena latar belakangnya gelap.

- 15 -

Sedangkan pada pewarnaan gram dengan bakteri Bacillus subtilis

Sp,

didapatkan bentuknya batang dengan warna ungu sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif. Sedangkan bakteri Escherichia coli Sp, didapat hasil dengan warna kemerahan dengan bentuk bulat sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut termasuk bakteri gram negatif. Sedangkan pada pewarnaan spora dengan bakteri Bacillus subtilis Sp, didapatkan warna hijau yang merupakan bagian spora, sedangkan warna merah merupakan bagian dari sel vegetatif dengan bentuk bakteri batang.

BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan Setelah menyelesaikan percobaan ini, dapat ditarik kesimpulan yaitu : 1. Pewarnaan memiliki beberapa jenis seperti pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan gram, pewarnaan spora dengan bakteri yang sama yaitu Bacillus subtilis Sp, kecuali pada pewarnaan gram yang juga menggunakan bakteri Escherichia coli Sp. 2. 3. Tujuan pewarnaan adalah untuk mengidentifikasi morfologi mikroba. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan seperti fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan zat warna penutup. 5.2 Saran Dalam melakukan percobaan ini sebaiknya jarum ose yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu dengan dipanaskan di atas lampu spiritus agar mikroba yang akan diamati dapat sesuai dengan yang diharapkan.

- 16 -

Daftar Pustaka
Pelczar, M.J, dan Chan, E.C.S., 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Penerbit UI : Jakarta Suriawiria, Unus. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti: Jakarta Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum, Universitas Muhammadiyah Malang : Malang

- 17 -

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI DAN MIKROBIOLOGI Pewarnaan dan Cara-cara Pewarnaan

DISUSUN OLEH : KELOMPOK III : Mery Natalia M.S Munaji Mahbub Afif Ni Luh Juniati Suitsi Siswanto Uswatun Hasanah Windra Anjas

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS MULAWARMAN

2007

- 18 -