E.

PEMBAHASAN

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam
langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu.
Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif
akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan
gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit
bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan Iodine pada bakteri. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna
yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian Iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk
memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.
Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri
menjadi semakin lebih kuat.
 Selanjutnya, alkohol diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan selama
20 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol merupakan
solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka
warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya
dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri
menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 20
detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan
pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat
atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan
waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan
komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian
zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri
berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca
objek dengan menggunakan air. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap
zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak
tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,
gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka
termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda
maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

Uji biokimia merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan untuk mengidentifikasi
dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri , hasil isolasi melalui sifat – sifat fisiologisnya
proses biokimia erat kaitannya dengan metabolism sel yakni selama reaksi kimia yang
dilakukan oleh sel yang menghasilkan energy maupun yang menggunakan energy untuk
sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan seluler seperti pergerakan.

Pada praktikum ini sebelum memulai pengecatan bakteri dilakukan pembuatan media dan
penanaman bakteri terlebih dahulu. Mediia yang dibuat yaitu NA cawan petri, NA miring, NB
Simmons Citrate Agar, LTA (Lysin Iron Agar), McConkey, dan TSIA (Triple Sugar Iron
Agar). Pada proses tersebut memerlukan waktu selama 24 jam karena media harus diinkubasi
terlebih dahulu agar media yang digunakan baik dan bakteri mampu hidup pada media yang
sudah dibuat. Penamaman bakteri dilakukan dengan metode goresan zigzag pada plate atau
cawan petri, zigzag dan tusuk pada media tabung. Pada hasil penanaman bakteri Saalmonella
sp. Pada media NA cawan petri, NA miring bakteri tumbuh pada media sesuai dengan goresan.
Pada media NB cair tidak ditumbuhi bakteri karena warna media masih sama seperti awal
sebelum ditanami bakteri yaitu berwarna bening. Penyebab bakteri tidak tumbuh pada media
kemungkinan disebabkan oleh pengaruh pH dan suhu.

Pada tes penggunaan sitrat media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini
adalah untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Pada
media Simonns citrat terdapat indicator BTB (Brom Tymol Blue). Apabila bakteri
menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka medi aberubah menjadi basa dan berubah
warna menjadi biru. Interpretasi hasil : negatif (-), tidak terjadinya perubahan warna media dari
warna hijau menjadi biru, artinya bakteri tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim
spesifik yang membawa sitrat kedalam sel.
 Pada tes dekarboksilasi lysin media LIA berbentuk padat, berwarna ungu didalam tabung
miring. Teknik isolasinya menggunakan teknik tusuk dam gores zigzag. Adapun tujuannya
untuk mengetahui apakah bakteri mengandung enzim dekarboksilase yang akan menguraikan
lysine menjadi caqaverin yang bersifat basa, karena adanya indicator brom Cresol Purple
(BCP) tetap berwarna ungu. Pada hasil percobaan, warna pada media terdiri dari lapisan
berwarna ungu dan lapisan berwarna bening yang menandakan bahwa bakteri hanya mampu
menguraikan lysin menjadi caqaverin sedikit sesuai dengan warna yang terlihat.

Pada tes H2S dan fermentasi gula-gula dengan menggunakkan media TSIA berbentuk
padat, berwarna merah didalam tabung miring. Teknik isolasinya menggunakan teknik tusuk
dan gores zigzag. Adapun tujuan dari tes ini adalah untuuk mengetahui apakah bakteri mampu
memfermentasi 3 gula TSIA (glukosa, laktosa, dan sukrosa) sehingga menghasilkan asam,
dengan adanya indicator phenol red akan berwarna kuning (asam = kuning). Sulfida : Untuk
mengetahui apakah bakteri mampu menguraikan Asam amino yang menguraikan sulfur
membentuk Asam Sulfid (H2S) bereaksi dengan besi (Fe) menjadi endapan Ferri Sulfid (FeS).
Berdasarkan pengamatan yang sudah dilakukan hasil dari tes ini menunjukan hasil yang positif

KESIMPULAN

Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri klebsiella pneumoniae yang berwarna
merah merupakan gram negative

Dari uji biokimia didapat beberapa kesimpulan :

 Pada uji penggunaan sitrat menunjukan bakteri salmonella sp. tidak mempunyai enzim
sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat kedalam sel
 Pada uji dekarboksilasi lysin menunjukan bakteri salmonella sp. mampu mengurai
lysin menjadi caqaverin dalam jumlah sedikit
 Pada uji H2S dan fermentasi gula-gula menunjukan bakteri salmonella sp. mampu
memfermentasi 3 gula TSIA (glukosa, laktosa, dan sukrosa) sehingga menghasilkan
asam dan mampu menguraikan Asam amino yang menguraikan sulfur membentuk
Asam Sulfid (H2S) bereaksi dengan besi (Fe) menjadi endapan Ferri Sulfid (FeS)