Pewarnaan Gram

Prinsip
Peawarnaan gram terdiri dari pewarnaan gram positif yang berwarna ungu (warna dasar) dan
pewarnaan gram negatif yang berwarna merah muda pada hasil akhir pengamatan.
Pewarnaan garam memerlukan 4 jenis reagen :
1. Pewarna Dasar
Merupakan pewarna basa. Contohnya : kristal violet yang merubah sel menjadi
berwarna ungu
2. Larutan Mordant
Merupakan senyawa pengikat warna dasar dan membentuk senyawa kompleks yang
tidak terlarut. Contohnya : larutan iodine (I) yang berikatan dengan kristal violet (CV)
menbentuk senyawa kompleks sehingga menjadikan seluruh sel menjadi berwarna
ungu gelap
3. Pencuci Warna
Merupakan larutan untuk mencuci warna dasar yang bergantung pada komposisi
dinding sel. Contohnya : etil alkohol yang melarutkan lemak pada dinding sel
sehingga akan terbentuk pori-pori yang ukurannya bergantung pada komposisi lemak
dinding sel
4. Pewarna Pembanding
Merupakan pewarna dengan warna kontras sebagai pembanding terhadap warna
dasar. Contohnya : safranin yang akan terlihat pada hasil akhir bila warna dasar
tercuci sehingga sel akan berwarna merah.

Teori Dasar
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).

Analisis

Gram Bacillus cereus literatur

Gram Bacillus cereus pengamatan

Berdasarkan literatur maka bila dilihat dari struktur bakteri Bacillus cereus berupa batanganbatangan kecil berwarna ungu tidak bersambungan namun berkoloni. Sedangkan berdasarkan
hasil pengamatan bakteri Bacillus cereus juga berupa batangan kecil berwarna ungu lebih
pekat dan berkoloni. Perbedaan kepekatan warna bakteri dipengaruhi jenis pewarna dan
konsentrasinya serta kemampuan baketri dalam menyerap warna. Namun dilihat secara
struktur, bakteri hasil penagamatan sudah sesuai dengan literatur.
Saat dilakukannya praktikum, hal pertama yang harus dilakukan adalah proses
sterilisasi. Sterilisasi diperlukan untuk menghilangkan mikroorganisme yang tidak diinginkan
agar lebih akurat dalam mengidentifikasi suatu mikroorganisme.
Sampel bakteri homogen yang dibiakan harus difiksasi agar menempel pada kaca
preparat. Fiksasi ini merupakan kondisi yang mengancam bakteri, maka beberapa jenis
bakteri membentuk spora ketika mengalami proses ini.
Pemberian larutan kristal violet berfungsi untuk memberi warna dasar ungu pada
apusan bakteri. Penganasan dilakukan untuk membantu larutan kristal violet menembus
dinding sel bakteri sehingga dapat berikatan dan memberi warna ungu pada bakteri.

Proses pencucian dengan aquades berfungsi membersihkan larutan kristal violet yang
ada sehingga yang ada hanya warna yang berikatan dengan sel bakteri sedangkan larutan
yang tidak berikatan terbawa aquades untuk dibuang.
Pemberian larutan lugol berfungsi sebagai larutan mordant yang mengikat pewarna
dasar dan membenetuk senyawa kompleks yang tidak terlarut. Kemudian perendaman dalam
larutan alkohol 96% berfungsi sebagai pelarut lemak pada dinding sel sehingga menimbulkan
efek dehidrasi alkohol. Apabila bakteri gram positif maka sel akan tetap berwarna ungu
karena kandungan lemak sedikit sedangkan apabila bakteri gram negatif, sel bakteri akan
tidak berwarna karena kandungan lemaknya yang tinggi sehingga mudah terlarut.
Penambahan safranin yang berwarna merah kontras dengan warna dasar berfungsi
sebagai pewarna pembanding sehingga bila bakteri gram negatif (tidak berwarna) maka yang
terlihat adalah warna pembanding (safranin) dan bila bakteri gram positif (warna dasar ungu)
maka warna yang terlihat adalah tetap warna dasar ungu pada pengamatan hasil akhir.
Pencucian dengan aquades kemudian dikeringkan menggunakan kertas isap dilakukan
kembali untuk membersihkan preparat dari zat warna yang berlebihan agar yang terlihat di
mikroskop hanya sel bakteri yang berwarna.
Dari hasil pengamatan akhir warna bakteri Bacillus cereus adalah ungu yang
mengindikasikan tergolong bakteri gram positif. Ini disebabkan Bacillus cereus adalah salah
satu jenis bakteri yang komposisi dinding selnya mengadung sedikit lemak sehingga saat
perendaman dalam alkohol, pori-pori yang terbentuk pada dinding sel lebih kecil dan lebih
sedikit warna dasar yang hilang saat pencucian. Karena warna sel bakteri tetap berwarna
dasar ungu maka penambahan pewarna pembanding safranin tidak tampak pada hasil akhir
pengamatan.

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).
http://www.microbelibrary.org/images/atlas-gram/bacillus%20cereus%20fig3.jpg