BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Umum
Mikroba adalah prokariot dengan dinding sel yang terdiri dari struktur khusus
yang disebut dengan peptidoglikan. Struktur ini mempunyai mekanisme tertentu
dalam hal penyerapan bahan-bahan dari lingkungan luar, termasuk zat warna
gram. Zat pewarna adalah garam yang terdiri dari atas ion positif dan ion negatif,
salah satu diantaranya berwarna. Hubungan bakteri dengan zat pewarna basa yang
menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar
dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam
nukleat bakteri bereaksi d e n g a n ion positif zat pewarna basa. Lembayung
kristal, safranin, dan b i r u metilen adalah beberapa zat pewarna basa yang lazim
dipakai. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri
menyeluruh. Jadi, mewarnai olesan bakteri dengan zat pewarna asam
menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja, karena sel bakteri
tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna. Teknik ini sangat berguna
untuk mengamati bentuk keseluruhan sel yang sangat kecil. Proses pewarnaan ini
disebut pewarnaan negatif. Perbedaan tebal tipisnya struktur peptidoglikan
menentukan mekanisme ya n g s p e s i f i k terhadap penyerapan zat warna. Sifat
ini digunakan u n t u k membantu identifikasi suatu bakteri, sehingga dikenal
adanya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Banyak senyawa organik
berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk
pemeriksaan mikroskopis (Tryana, 2008).
Metode pewarnaan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya sehingga pewarnaan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang
tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Tryana, 2008).
Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk (Pelczar, 1986):
1.

Mengetahui dengan lebih baik bagian dari mikroorganisme secara kasar;

2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorgaisme;

3. Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme serupa.
Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai
untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986):
1.
2.
3.

Penempatan olesan atau lapisn tipis spesimen pada kaca objek;

Fiksasi olesan pada kaca objek;
Aplikasi pewarnaan tunggal (pewarnaan tunggal) atau serangkaian atau
serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarna diferensial).

2. 1 Jenis-jenis pewarnaan gram

Jenis-jenis pewarnaan terdiri dari (Sri Hadioetoemo, 1985):
1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana adalah tipe pewarnaan yang paling sederhana. Caranya
hanyalah dengan menambahkan olesan yang telah difiksasi. Zat warna yang
digunakan pada pengecatan gram adalah :
1. Kristal violet
Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi
warna mikroorganisme target. Kristal Violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu).
2. Yodium
Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium
pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna
oleh bakteri.
3. Alkohol
Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan
zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada
pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan:
1. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu;
2. Bakteri menjadi tidak berwarna.
4. Safranin

II-2

Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini

berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna
utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan
warna pada mikroorganisme non target.
2. Pewarnaan diferensial
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan antara sel-sel mikroba atau
bagianbagian dari mikoba yang disebut dengan teknik pewarnaan diferensial.
Dengan teknik ini bisanya digunakan lebih dari satu larutan zat pewarna.
3. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang
paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.
Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan
berikut: zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan
pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air
fuchsin. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua
kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif
akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan
sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin
atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
2.3 Faktor yang mempengaruhi pewarnaan gram
Faktor-faktor yang mempengaruhi keragaman dalam reaksi gram ialah
(Syaputra, 2009):
a. Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan
Olesan bakteri yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan
pecahnya dinding sel. Dalam keadaan demikian, maka sel-sel gram positf akan
melepaskan warna primer dan menerima pewarnaan tandingan.

II-3

b. Kerapatan sel pada olesan

Olesan yang baik hendaknya jangan terlalu tebal atau terlalu tipis. Pada
pewarnaan gram, olesan yang terlampau tebal tidak akan memucat secepat
seperti olesan dengan kerapatan sel yang normal.
c. Sifat, konsentrasi, dan jumlah pemucat yang dipakai
Pemucat yang paling banyak digunakan ialah campuran etanol 95 % dan aseton
(1:1).
d. Sejarah biakan
Maksudnya adalah umur biakan serta keasaman atau alkalinitas (pH)
medium tempat bakteri yang bersangkutan ditumbuhkan.
2.4 Tujuan pewarnaan gram
Tujuan dari pewarnaan ini adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel vakuola, menghasilkan sifat-sifat
fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan
kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Syaputra, 2009).

II-4