PERBENIHAN BAKTERI Asih Rahayu,drh.,M.Kes. LAB. MIKROBIOLGI FK UWKS IDENTIFIKASI BAKTERI Identifikasi bakteri penyebab penyakit infeksi dilakukan di laboratorium Mikrobiologi dengan mengirimkan sampel penderita (mengenai sampel dibahas lebih lanjut pada Bab Pengambilan Spesimen & interpretasi Hasil Pemeriksaan Laboratorium Mikrobiologi) Sampel yang diterima oleh lab akan dikerjakan sesuai permintaan dokter pengirimnya
PEMERIKSAAN RUTIN LAB MIKROBIOLOGI UNTUK BAKTERI Setiap sampel untuk pemeriksaan bakteri yang diterima oleh lab Mikrobiologi akan dilakukan pemeriksaan sbb: 1. Pemeriksaan mikroskopis untuk mengetahui morfologi & sifat afinitas bakteri terhadap zat warna 2. Kultur (perbenihan) untuk mengetahui sifat fisiologis & kimiawi bakteri 3. Hewan coba (bila perlu) ; saat ini sudah sangat jarang dilakukan 1.PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS Untuk memeriksa bakteri secara mikroskopis perlu dilakukan pewarnaan /pengecatan Jenis pewarnaan yang dipergunakan disesuaikan dengan kebutuhan / permintaan masing masing spesimen yang dikirimkan Umumnya dilakukan pewarnaan rutin lab Mikrobiologi yaitu Pewarnaan Gram, kecuali terdapat indikasi lain misalnya untuk spesimen penderita yang diduga TBC atau lepra , tidak dilakukan pewarnaan Gram melainkan pewarnaan Tahan Asam Terdapat banyak jenis pewarnaan, pada kuliah ini hanya dipelajari beberapa yang dasar & sangat penting diketahui oleh seorang calon praktisi/dokter PEWARNAAN berdasarkan ikatan zat warna dengan sito- plasma bakteri
POSITIF -Zat warna dapat ber- ikatan dengan sito- plasma bakteri NEGATIF -zat warna tidak dapat berikatan dengan sito- plasma bakteri Pewarnaan yang bersifat positif Karena mempergunakan zat warna yang dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri, maka di bawah mikroskop bakteri akan tampak berwarna sesuai dengan warna zat yang dipakai Zat warna yang dipakai harus bersifat basa ( basic dyes) untuk dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri yang cenderung bersifat asam Contoh zat warna yang bersifat basa: Crystal violet berwarna ungu Safranin berwarna merah Methylene Blue berwarna biru Carbol fuchsin berwarna merah Malachite Green berwarna hijau ; larut dalam air Neisser AB & Neisser C larut dalam air
Macam Pewarnaan yang bersifat positif 1. Sederhana / simple staining : mempergunakan 1 macam zat warna basa ; tujuannya hanya untuk mengetahui bentuk/morfologi & susunan bakteri secara cepat 2. Differential : dapat membedakan sifat sifat bakteri berdasarkan afinitas terhadap zat warna ; mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa ; selain untuk mengetahui bentuk & susunan bakteri juga untuk mengetahui sifat bakteri berdasarkan afinitas terhadap zat warna misalnya sifat Gram,sifat Acid fast 3. Khusus: mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa; untuk mengetahui bagian bagian khusus yang dimiliki oleh bakteri misalnya Granula metachromatic, endospora / spora, capsule dll
PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIF Karena menggunakan zat warna yang tidak dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri, maka di bawah mikroskop bakteri akan tampak bening / tidak terwarnai & hanya latar belakang / daerah di sekitar bakteri yang akan terwarnai Zat warna yang dipakai harus bersifat asam / acidic dyes sehingga tidak dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri yang cenderung bersifat asam Contoh zat warna yang bersifat asam : tinta bak, chinese ink, indian ink, nigrosin
MACAM PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIF Burrie / negative stain : mempergunakan 1 macam zat warna asam ; untuk mengetahui morfologi & susunan bakteri serta umumnya dipakai untuk mewarnai bakteri bakteri yang sulit diwarnai ( sulit menyerap zat warna basa ) atau dapat juga dipakai untuk mewarnai bakteri bercapsule Membuat preparat / sediaan bakteri untuk pewarnaan Secara detail langkah langkahnya lihat Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi Yang perlu diingat adalah : 1. Pakai object glass bersih & bebas lemak (baru) 2. Siapkan ose yang lingkarannya menyatu 3. Siapkan nyala api bunsen 4. Bila bakteri diambil dari biakan cair tidak perlu PZ steril 5. Bila bakteri diambil dari biakan padat perlu PZ steril 6. Selalu bekerja secara ASEPTIS 7. Preparat harus difixasi setelah benar benar kering PEWARNAAN SEDERHANA = SIMPLE STAINING Mempergunakan 1 macam zat warna basa ; zat warna yang dianjurkan : safranin & methylene blue Di bawah mikroskop bakteri akan tampak berwarna merah bila menggunakan safranin ; bila menggunakan methylene blue, bakteri akan tampak berwarna biru Secara detail langkah-langkahnya lihat Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi Informasi yang didapat dari pewarnaan ini hanyalah morfologi & susunan bakteri Morfologi : coccus ; batang = bacill panjang, pendek, sangat pendek, kurus , gemuk, kecil, besar, mempunyai spora (spora tampak sebagai daerah tak berwarna karena spora tidak dapat ditembus zat warna) dll Notes: bentuk batang yang sangat pendek sehingga mirip coccus disebut sebagai cocoid atau coccobacill Susunan : bergerombol, membentuk rantai, seperti huruf cina, berdua, berempat berdelapan, sendiri sendiri dll PEWARNAAN GRAM Merupakan pewarnaan differential untuk membedakan antara bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif berdasarkan afinitas dinding sel bakteri terhadap zat warna Gram Gram merupakan nama penemu pewarnaan ini tulis huruf awal dengan huruf capital Secara detail langkah langkahnya lihat di Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu : Crystal violet ( berwarna ungu ) sebagai zat warna utama = main stain & safranin (berwarna merah) sebagai zat warna pembanding = counter stain Mempergunakan zat kimia pelarut organik : Alkohol absolut = alkohol 95 96 % sebagai decolorizing agent = peluntur Mempergunakan zat kimia : lugol (KI 3 3%) sebagai mordant = pemantek = zat yang membantu pengikatan zat warna Crystal violet dengan sitoplasma bakteri (Iodine- dye complex) Bakteri yang mempunyai struktur dinding sel peptidoglikan yang tebal mempertahankan zat warna crystal violet pada saat pelunturan warna tetap ungu Gram POSITIF Bakteri yang mempunyai struktur dinding sel peptidoglikan yang tipis tidak dapat mempertahankan zat warna crystal violet pada saat pelunturan akan mengikat zat warna pembanding ( safranin) warna merah Gram NEGATIF PEWARNAAN ACID FAST = Pewarnaan Tahan Asam = Pewarnaan Ziehl- Neelsen Ada beberapa metode , diantaranya Ziehl-Neelsen , Tan Thiam Hok dari nama orang penemunya Langkah langkah secara detail lihat Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi metode Ziehl Neelsen Merupakan pewarnaan diffrential untuk membedakan antara bakteri yang tahan asam (Acid Fast) dengan bakteri yang tidak Tahan Asam ( Non Acid Fast) Contoh bakteri Acid Fast adalah : Mycobacterium leprae & Mycobacterium tuberculosis
Mempergunakan 2 macam zat wana basa yaitu: Carbol Fuchsin ( wana merah ) sebagai main stain dengan Methylene Blue ( warna biru) sebagai counter stain Mempergunakan zat kimia pelarut organik yang kuat yaitu Alkohol asam (larutan Alkohol + HCl) sebagai decolorizing agent Mempergunakan tehnik pemanasan preparat untuk merenggangkan pori dinding sel / lapisan mycolic acid bakteri yang bersifat tahan asam , sehingga diharapkan zat warma Carbol Fuchsin dapat masuk & berikatan dengan sitoplasma bakteri Bakteri yang mempunyai struktur dinding sel mycolic acid akan mempertahakan zat warna Carbol Fuchsin pada saat pelunturan Bakteri Acid Fast / bakteri tahan Asam berwarna merah Bakteri yang tidak mempunyai struktur dinding sel mycolic acid tidak dapat mempertahankan zat warna Carbol Fuchsin akan mengikat zat warna pembanding Methylene Blue bakteri tidak Tahan Asam / Non Acid Fast berwarna biru PEWARNAAN SPORA = Pewarnaan Schaeffer-Foulton nama penemu pewarnaan ini Merupakan pewarnaan khusus untuk melihat spora (endospora) bakteri Bakteri yang dapat membentuk spora (bentuk pertahanan diri/tidak aktif) misalnya Bacillus sp & Clostridium sp Letak & diameter spora adalah karakteristik Letak : central, sub terminal, terminal Diameter : lebih kecil atau lebih besar dari diameter bagian vegetatif bakteri Bentuk spora : bulat atau oval Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu : Malachite Green (warna hijau) sebagai main stain & safranin (warna merah) sebagai counter stain Mempergunakan tehnik pemanasan untuk merenggangkan dinding spora yang tebal & impermiable sehingga diharapkan zat warna Malachite Green dapat menembus dinding spora warna spora hijau Karena Malachite Green larut dalam air maka bagian vegetative bakteri akan melepas warna malachite green & mengikat warna safranin bagian vegetative berwarna merah
PEWARNAAN NEISSER Merupakan pewarnaan khusus : untuk melihat granula metachromatic bakteri Contoh bakteri patogen yang mempunyai granula metachromatic adalah Corynebacterium diphteriae Menggunakan 2 macam zat warna basa Neisser AB & Neisser C (keduanya larut dalam air) oleh karena itu selama pewarnaan tidak boleh ada proses pencucian Secara detail dapat dilihat pada Buku Praktikum I Mikrobiologi Granula metachromatik tampak berwarna biru gelap & sitoplasma bakteri akan tampak kuning kecoklatan
PEWARNAAN NEGATIF = negative stain = Burrie nama penemunya Menggunakan zat warna asam,umumnya tinta bak dengan kualitas yang baik Metode Pembuatan preparat bakteri untuk pewarnaan negatif berbeda dengan metode pembuatan preparat bakteri untuk pewarnaan positif (simple, Gram, Acid Fast, Spora,Neisser) yaitu dengan tehnik ulas Bakteri tampak tidak berwarna (transparant) dengan latar belakang hitam /gelap Catatan: Pewarnaan yang menggunakan metode pemanasan preparat : Acid Fast & Spora Pewarnaan yang menggunakan metode pelunturan: Gram (alkohol 95-96%) & Acid Fast (alkohol asam) Pada pewarnaan dengan metode pemanasan : selama pemanasan preparat tidak boleh kering & tidak boleh mendidih Semua jenis pewarnaan terdapat tahap pencucian dengan air (pergunakan air kran) , kecuali pada pewarnaan Neisser Staphylococcus sp Gram positif, coccus, umumnya bergerombol seperti buah anggur Streptococcus sp Gram positif, coccus , umumnya berjajar membentuk rantai Escherechia coli Gram negatif, batang / bacill, umumnya sendiri sendiri Bacillus subtilis Gram positif , mempunyai spora ( tampak transparant pada pewarnaan Gram), batang besar, umumnya berjajar membentuk rantai Mycbacterium tuberculosis Acid Fast / Tahan Asam, umumnya bergerombol atau sendiri - sendiri Mycobacterium leprae Acid Fast / Tahan Asam, umumnya bergerombol membentuk formasi potongan melintang cerutu (globi / globus) atau sendiri sendiri Preparat yang ditemukan bakteri bentuk batang Tahan Asam disimpulkan sebagai BTA positif